超敏版人腫瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α(TNF-α) 酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)吸(xi)附測定(ding)試劑(ji)盒(he)

超敏版人腫瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α(TNF-α) 酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)吸(xi)附測定(ding)試劑(ji)盒(he)

腫(zhong)瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α（ TNF-α) 簡(jian)介：

腫瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α（ TNF-α)  由(you)中(zhong)性粒細胞(bao)、活化的(de)淋巴(ba)細(xi)胞(bao)、 巨噬(shi)細(xi)胞(bao)、NK    細胞(bao)、LAK細胞(bao)、星形膠(jiao)質(zhi)細胞(bao)內皮(pi)細(xi)胞(bao)、平滑(hua)肌(ji)細胞(bao)和壹(yi)些(xie)轉化細(xi)胞(bao)產生(sheng)。 小(xiao)鼠TNF-α以膜(mo)錨定(ding)的形式(shi)出現。 自然發(fa)生的TNF-α形式(shi)是糖基化的(de) ，但非   糖基化的(de)重(zhong)組(zu)TNF-α具(ju)有(you)相(xiang)當(dang)的(de)生(sheng)物(wu)活性。人類和鼠類(lei)的TNF-α在(zai)氨基酸水(shui)   平(ping)上(shang)顯(xian)示(shi)出大約79%的同源(yuan)性。

實驗(yan)原(yuan)理：

本試劑盒(he)采用雙(shuang)抗(kang)體夾心(xin)法酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)吸(xi)附試驗(yan)（ ELISA） 。往預先(xian)包(bao)被(bei)有(you)人 腫瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α(TNF-α)捕(bu)獲抗(kang)體的微孔中，依次加入(ru)樣(yang)本、標(biao)準品(pin)、生(sheng)物(wu)素標(biao) 記(ji)的(de)檢測抗(kang)體 ，HRP酶(mei)結(jie)合物 ， 中間(jian)經(jing)過溫育(yu)和洗(xi)滌(di) ， 用底(di)物TMB顯(xian)色(se) ， TMB在過(guo)氧(yang)化物(wu)酶(mei)(HRP)的(de)催化下(xia)轉化成(cheng)藍色(se) ，並在(zai)酸(suan)的作用下(xia)轉化成(cheng)最終(zhong)的 黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的深淺和樣(yang)本中的人腫瘤壞(huai)死(si)因子(zi)α(TNF-α)呈正(zheng)相(xiang)關。用(yong)酶(mei)標(biao)儀(yi)在(zai) 450nm  波(bo)長下(xia)測(ce)定吸(xi)光(guang)度(du)（ OD值） ，計算樣(yang)本濃度(du)。

靈敏度(du)：7.65pg/mL

特異(yi)性：可檢測樣(yang)本中人的TNF-α ,  且與其類似(si)物(wu)無明(ming)顯(xian)交(jiao)叉反應(ying)。

檢測範(fan)圍(wei)： 15.62-1000pg/mL

樣本稀釋(shi)：

請提(ti)前(qian)預估(gu)樣(yang)本的濃度(du)範圍(wei) ，如(ru)果您的(de)檢測樣(yang)本需(xu)要(yao)稀(xi)釋(shi) ，參考(kao)稀(xi)釋(shi)方案如(ru)下(xia)：

稀(xi)釋(shi) 100 倍(bei)：壹(yi)步(bu)稀釋(shi)。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ，做(zuo) 100 倍(bei)稀(xi)釋(shi)；

稀釋(shi) 1000 倍(bei) ：兩步稀(xi)釋(shi)。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ，做(zuo) 20 倍(bei)稀(xi)釋(shi) ， 再取 5μL 20 倍(bei)稀(xi)釋(shi)樣本到 245μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ， 做(zuo) 50 倍(bei)稀(xi)釋(shi) ， 總共稀(xi)釋(shi) 1000 倍(bei)；

稀(xi)釋(shi) 100000 倍(bei) ：三步(bu)稀釋(shi)。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ，做(zuo) 40 倍(bei)稀(xi) 釋(shi) ，再取 5μL 40 倍(bei)稀(xi)釋(shi)樣本到 245μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ，做(zuo) 50 倍(bei)稀(xi)釋(shi) ，最後取 5 μL 2000 倍(bei)稀(xi)釋(shi)樣本到 245μL 通用稀(xi)釋(shi)液內 ，做(zuo) 50 倍(bei)稀(xi)釋(shi) ，總共稀(xi)釋(shi) 100000 倍(bei)；每步(bu)稀釋(shi)時取液量不少於 3μL ，稀釋(shi)倍(bei)數(shu)不(bu)超過(guo) 100 倍(bei)。每步(bu)稀釋(shi)都需(xu)混(hun)合均(jun) 勻 ，避(bi)免(mian)起泡(pao)。

1.    從室溫平衡10分(fen)鐘(zhong)後的鋁(lv)箔袋中(zhong)取(qu)出所(suo)需(xu)板(ban)條 ，剩余板(ban)條用自封(feng)袋密封 放回(hui)4℃。

2.    加(jia)樣(yang) ：分(fen)別將(jiang)樣本或(huo)不同濃度(du)標(biao)準品(pin)按(an)照100μL每孔加入(ru)相(xiang)應(ying)孔中 ，空(kong) 白孔加入(ru)100μL通用稀(xi)釋(shi)液。蓋上封板膜(mo)後37℃溫育(yu)60分鐘(zhong)。（建議：

將(jiang)待(dai)測(ce)樣(yang)本用通用稀(xi)釋(shi)液稀釋(shi)1倍(bei)後再加(jia)入(ru)酶(mei)標(biao)板(ban)內測試(shi)。從而(er)減(jian)   少基質效應(ying)對測(ce)試結果的影(ying)響 ，最(zui)後計算樣(yang)本濃度(du)時需(xu)乘以對應(ying)的稀(xi)釋(shi) 倍(bei)數(shu)。所(suo)有(you)的待測樣本和標(biao)準品(pin)在(zai)檢測中(zhong)建議設立復孔）。

3.    加生(sheng)物素(su)化檢抗 ：取(qu)出酶(mei)標(biao)板(ban) ，棄(qi)去(qu)液體 ，不用(yong)洗(xi)滌(di)。每孔直接加入(ru)

100μL生(sheng)物(wu)素化檢抗工(gong)作液 ，蓋上封板膜(mo)後37℃溫育(yu)60分鐘(zhong)。

4.    洗板 ：棄去液體 ，每孔加入(ru)300μL 1x洗(xi)滌(di)液 ，靜置(zhi)1分鐘(zhong) ，甩(shuai)去洗滌(di)液， 吸(xi)水紙(zhi)上拍幹 ，如此(ci)重(zhong)復(fu)洗(xi)板(ban)3次（也(ye)可用(yong)洗(xi)板(ban)機洗板(ban)）。

5.    加酶(mei)結(jie)合物工作(zuo)液 ：每孔加入(ru)100μL酶(mei)結(jie)合物工作(zuo)液 ，蓋上封板膜(mo)後 37℃溫育(yu)30分鐘(zhong)。

6.    洗板 ：棄去液體按步(bu)驟(zhou)4洗滌(di)方法 ，洗板(ban)5次。

7.    加底(di)物 ：每孔加入(ru)90μL底(di)物(TMB) ，蓋上封(feng)板膜(mo) ，37℃避(bi)光(guang)溫育(yu)15分鐘(zhong)。

8.    加終(zhong)止液 ：取出酶(mei)標(biao)板(ban) ，每孔直接加入(ru)50μL終(zhong)止液 ，立即(ji)在(zai)450nm波長 處(chu)測定(ding)各孔的OD值。

結果判(pan)斷：

1.    計算標(biao)準品(pin)和樣(yang)本復孔的平(ping)均(jun)  OD  值並減(jian)去空(kong)白(bai)孔的  OD  值作為(wei)校(xiao) 正值。 以濃度(du)為橫(heng)坐(zuo)標(biao) ，OD  值為縱坐(zuo)標(biao) ，在雙(shuang)對(dui)數(shu)坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上繪出四(si)參 數(shu)邏(luo)輯(ji)函數(shu)的(de)標(biao)準曲線(xian)。

2.    若樣(yang)本 OD  值高於標(biao)準曲線(xian)上(shang)限 ，應(ying)適當(dang)稀(xi)釋(shi)後重(zhong)測(ce)並在(zai)計算樣(yang)本濃度(du) 時乘以相(xiang)應(ying)的稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)。

典型數(shu)據(ju)和參考(kao)曲(qu)線(xian)：

以下(xia)數(shu)據(ju)和曲(qu)線(xian)僅(jin)供(gong)參考(kao) ，實驗者(zhe)需(xu)根(gen)據(ju)自己的實(shi)驗(yan)建立標(biao)準曲線(xian)。

註(zhu)意(yi) ：本圖僅(jin)供(gong)參考(kao) ，應(ying)以每次實驗(yan)數(shu)據(ju)所(suo)繪制(zhi)標(biao)準曲線(xian)計算樣(yang)本含(han)量。

1.    重(zhong)復(fu)性 ：板內變(bian)異(yi)系(xi)數(shu)小(xiao)於  10% ，板間變(bian)異(yi)系(xi)數(shu)小(xiao)於  10%。

2.    回收率 ：在選(xuan)取的健(jian)康人血清、血漿和細(xi)胞(bao)培養(yang)上(shang)清中加(jia)入(ru)  3  個不同 濃度(du)水平(ping)的人TNF-α ,  計算回(hui)收率。

3.    線(xian)性稀釋(shi)：分別在(zai)選(xuan)取的4份(fen)健康人血清、血漿和細(xi)胞(bao)培養(yang)上(shang)清中加(jia)入(ru)

高濃度(du)人TNF-α ,  在標(biao)準曲線(xian)動(dong)力學範(fan)圍(wei)內進行(xing)稀釋(shi) ，評估(gu)線(xian)性。