S-腺苷甲硫(liu)氨酸(SAM)競爭法ELISA試(shi)劑(ji)盒技術(shu)解析(xi)與應用(yong)

實驗(yan)原理

本試(shi)劑(ji)盒采(cai)用(yong)競爭法酶(mei)聯免疫(yi)吸附試(shi)驗(yan)（ELISA）。在預(yu)包(bao)被抗S-腺苷甲硫(liu)氨酸（SAM）抗體（固相(xiang)抗體）的(de)微(wei)孔酶標(biao)板中，加(jia)入(ru)S-腺苷甲硫(liu)氨酸（SAM）校準(zhun)品和(he)待(dai)測(ce)樣本，再(zai)加入(ru)HRP標記(ji)的(de)S-腺苷(gan)甲硫(liu)氨酸（SAM）抗原（酶標(biao)抗原），經過溫(wen)育(yu)與充(chong)分(fen)洗滌(di)，去(qu)除(chu)未(wei)結(jie)合的(de)組分(fen)，在(zai)微(wei)孔板固相(xiang)表(biao)面形(xing)成固相(xiang)抗體-酶標抗原的(de)免疫(yi)復(fu)合物。加底物A和(he)B，底(di)物在HRP催化(hua)下，產(chan)生(sheng)藍色(se)產(chan)物，在終止液（2M 硫酸）作用(yong)下(xia)，最終轉化(hua)為黃色(se)，在(zai)酶(mei)標(biao)儀450nm波長(chang)上測定吸光(guang)度(du)（OD值），吸光(guang)度(du)（OD值）與待(dai)測樣品(pin)中S-腺(xian)苷甲硫(liu)氨酸（SAM）的(de)濃度(du)負(fu)相(xiang)關(guan)。擬(ni)合校準(zhun)品曲線，可(ke)以(yi)計(ji)算(suan)出(chu)樣本中S-腺(xian)苷(gan)甲硫(liu)氨酸（SAM）的(de)濃度(du)。

S-腺苷(gan)甲硫(liu)氨酸(SAM)競爭法ELISA試(shi)劑(ji)盒技術(shu)解析(xi)與應用(yong)

摘要

S-腺(xian)苷(gan)甲硫(liu)氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是(shi)生物體內重要的(de)甲基(ji)供體(ti)，參與多(duo)種生化(hua)反應。本文詳(xiang)細(xi)介(jie)紹了(le)SAM競爭法ELISA試(shi)劑(ji)盒的(de)工(gong)作原理、實驗(yan)流程、技術(shu)特(te)點及應用(yong)領(ling)域，為研(yan)究人員提(ti)供全面的(de)技術(shu)參(can)考。

1. 引言(yan)

S-腺(xian)苷甲硫(liu)氨酸(SAM)作為(wei)生(sheng)物體內關鍵(jian)的(de)甲基(ji)供體(ti)，在DNA甲基(ji)化(hua)、神經遞(di)質(zhi)合成、磷脂(zhi)代(dai)謝(xie)等過程(cheng)中(zhong)發揮(hui)重要作(zuo)用(yong)。準(zhun)確(que)測(ce)定SAM水平對(dui)於研(yan)究甲基(ji)化(hua)代(dai)謝(xie)、肝(gan)臟(zang)疾(ji)病(bing)、神經系(xi)統疾(ji)病(bing)等(deng)具有重要意(yi)義(yi)。競爭法ELISA以(yi)其(qi)高特(te)異(yi)性(xing)、高靈敏度(du)和(he)操(cao)作(zuo)簡(jian)便等優(you)勢，成為檢(jian)測(ce)SAM的(de)重要工(gong)具。

2. SAM競爭法ELISA試(shi)劑(ji)盒工(gong)作原理

競爭法ELISA基(ji)於以(yi)下(xia)原理：

1. 微(wei)孔板預(yu)先包(bao)被SAM類似物或結(jie)合蛋白(bai)

2. 樣品(pin)中的(de)SAM與酶(mei)標記(ji)的(de)SAM競爭結(jie)合有限(xian)數量(liang)的(de)抗體結(jie)合位點

3. 樣品(pin)中SAM濃度(du)越高，與抗體結(jie)合的(de)酶標(biao)SAM越(yue)少(shao)

4. 加入(ru)底物顯色(se)後(hou)，通過測(ce)定吸光(guang)度(du)值，其(qi)強(qiang)度(du)與樣品(pin)中SAM濃度(du)呈(cheng)反比(bi)

反應公式(shi)可(ke)表示為：

[Ab] + [SAM*] + [SAM] ↔ [Ab-SAM*] + [Ab-SAM]

其中(zhong)Ab為抗體，SAM*為酶標(biao)SAM，SAM為(wei)待(dai)測樣品(pin)中的(de)SAM試(shi)劑(ji)盒組(zu)分(fen)與保存(cun)

未(wei)開封的(de)試(shi)劑(ji)盒保存(cun)在(zai)2-8度(du)，不得(de)使(shi)用(yong)過期(qi)試(shi)劑(ji)盒。

標準(zhun)品濃度(du)依次(ci)為(wei)：120、60、30、15、7.5、0 ng/mL.

其(qi)他用(yong)品(pin)

1、 酶標儀（450nm）

2、 精密(mi)移液器(qi)及(ji)壹(yi)次(ci)性吸頭(tou)

3、 蒸(zheng)餾(liu)水

4、 洗瓶或(huo)者自(zi)動(dong)洗板機

5、 37℃水浴鍋(guo)或恒(heng)溫(wen)箱(xiang)

6、 500ml量(liang)筒(tong)

樣品(pin)的(de)采(cai)集和(he)儲(chu)存(cun)

以(yi)下(xia)只是(shi)列(lie)出(chu)樣品(pin)采(cai)集和(he)保存(cun)的(de)壹(yi)般(ban)指(zhi)南(nan)。所(suo)有樣本采(cai)集保存(cun)過程(cheng)中(zhong)，不得(de)使(shi)用(yong)疊(die)氮鈉做為防(fang)腐(fu)劑(ji)。

1、 細(xi)胞培養上清：4000rpm條(tiao)件下(xia)離(li)心(xin)20min，去(qu)除(chu)細(xi)胞顆(ke)粒(li)和(he)聚(ju)合物，上清液保存(cun)在(zai)- 20℃以(yi)下(xia)，避免反復(fu)凍融。

2、 血(xue)清：使(shi)用(yong)不(bu)含(han)熱(re)原和(he)內(nei)毒(du)素(su)的(de)試(shi)管，操(cao)作(zuo)過程(cheng)中(zhong)避免任(ren)何細(xi)胞刺(ci)激(ji)，4000rpm條件下離(li)心(xin)20min，小(xiao)心(xin)地(di)分(fen)離(li)出(chu)血(xue)清，保存(cun)在(zai)-20℃以(yi)下(xia)，避免反復(fu)凍融。

3、 血(xue)漿：肝(gan)素(su)，EDTA，或檸檬(meng)酸鈉作(zuo)為(wei)抗凝(ning)劑(ji)。在4000rpm條(tiao)件下(xia)，離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)取上清，血(xue)漿保存(cun)在(zai)-20℃以(yi)下(xia)，避免反復(fu)凍融。

樣本收集後，無(wu)法壹(yi)次(ci)檢測完畢，請(qing)按壹(yi)次(ci)用(yong)量(liang)分(fen)裝(zhuang)凍存(cun)，避(bi)免反復(fu)凍融，使(shi)用(yong)時在室(shi)溫下解凍，確(que)保樣品(pin)均勻(yun)充(chong)分(fen)解凍。

4、 組織(zhi)勻(yun)漿：用(yong)預(yu)冷的(de)PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去(qu)除(chu)殘(can)留血(xue)液，稱(cheng)重後將(jiang)組織(zhi)剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪碎的(de)組織(zhi)與對(dui)應體積(ji)的(de)PBS(壹(yi)般(ban)按(an)1: 9的(de)重量(liang)體(ti)積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的(de)組織(zhi)樣品(pin)對(dui)應9 mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可(ke)根(gen)據實驗(yan)需(xu)要適當(dang)調整，並(bing)做好記(ji)錄(lu)。推(tui)薦(jian)在(zai)PBS中(zhong)加(jia)入(ru)蛋白(bai)酶抑(yi)制劑(ji))加入(ru)玻璃(li)勻(yun)漿器(qi)中(zhong)，在冰上充(chong)分(fen)研(yan)磨。為(wei)了(le)進壹(yi)步(bu)裂(lie)解組織(zhi)細(xi)胞，可(ke)以(yi)對(dui)勻(yun)漿液進行(xing)超(chao)聲破碎(sui)或反復(fu)凍融。最(zui)後(hou)將勻(yun)漿液5000×g離(li)心(xin) 5-10分(fen)鐘(zhong)，取上清檢(jian)測。

5、 細(xi)胞提(ti)取(qu)液：貼壁細(xi)胞用(yong)冷的(de)PBS輕輕(qing)清(qing)洗，然(ran)後(hou)用(yong)胰(yi)蛋白(bai)酶消(xiao)化(hua)，1000×g離(li)心(xin)5分(fen)鐘(zhong)後收集細(xi)胞；懸(xuan)浮(fu)細(xi) 胞可(ke)直接(jie)離(li)心(xin)收集。收集的(de)細(xi)胞用(yong)冷的(de)PBS洗滌(di)3次(ci)。每(mei) 1×106 個(ge)細(xi)胞中加(jia)入(ru)150-200μLPBS重懸(xuan)並(bing)通過反復(fu)凍融使(shi)細(xi)胞破碎(sui)(若(ruo)含(han)量(liang)很(hen)低(di)可(ke)減(jian)少(shao)PBS的(de)體積(ji))。將(jiang)提(ti)取(qu)液於1500×g離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)，取上清檢(jian)測。  

6、 其(qi)他生物體液：1000×g 離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)，除去(qu)雜(za)質(zhi)及(ji)細(xi)胞碎片。取上清檢(jian)測。

試(shi)劑(ji)準(zhun)備

1、 使(shi)用(yong)前(qian)，所有的(de)組分(fen)都(dou)要至(zhi)少(shao)復(fu)溫(wen)60min，確(que)保充(chong)分(fen)復(fu)溫(wen)到室(shi)溫。

2、 濃縮(suo)洗滌(di)液：從冰(bing)箱取(qu)出(chu)的(de)濃縮(suo)洗滌(di)液，會(hui)有結(jie)晶(jing)產(chan)生(sheng)，這(zhe)屬於正(zheng)常(chang)現(xian)象，水浴加(jia)熱(re)使(shi)結(jie)晶(jing)溶(rong)解。濃縮(suo)洗滌(di)液與蒸(zheng)餾(liu)水，按1:20稀(xi)釋(shi)，即1份(fen)的(de)濃縮(suo)洗滌(di)液，添加19份(fen)的(de)蒸(zheng)餾(liu)水。

3、 底物：底物液A和(he)B，在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)，按1:1體積(ji)充(chong)分(fen)混合，混合後15分(fen)鐘(zhong)內使(shi)用(yong)。

操(cao)作(zuo)程序

所(suo)有試(shi)劑(ji)和(he)組(zu)分(fen)都(dou)先恢復(fu)到室(shi)溫，標準(zhun)品、質(zhi)控品和(he)樣品(pin)，建議(yi)做復(fu)孔。

1、 按前(qian)面說明(ming)書描述(shu)的(de)方(fang)法，配(pei)制好試(shi)劑(ji)盒各(ge)種組分(fen)的(de)工(gong)作液。

2、 從鋁(lv)箔(bo)袋中(zhong)取出(chu)所(suo)需(xu)板條，剩(sheng)余的(de)板條用(yong)自(zi)封袋(dai)密(mi)封放(fang)回冰箱。

設(she)置標(biao)準(zhun)品孔、空白(bai)孔和(he)樣本孔，標準(zhun)品孔各(ge)加(jia)不同(tong)濃度(du)的(de)標準(zhun)品50μL，空(kong)白(bai)孔不加(jia)，樣本孔加待(dai)測樣本50μL。

3、除空(kong)白(bai)孔外，標(biao)準(zhun)品孔和(he)樣本孔，加入(ru)辣根(gen)過氧(yang)化(hua)物酶（HRP）標記(ji)的(de)檢測(ce)抗原100μL。

4、 用(yong)封(feng)板膜(mo)蓋(gai)住反應板，37℃水浴鍋(guo)或恒(heng)溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育60min。

5、 揭開封板膜(mo)，棄去(qu)液體，吸水紙上拍(pai)幹(gan)，每(mei)孔加滿(man)洗滌(di)液，靜(jing)置20S，甩去(qu)洗滌(di)液，吸水紙上拍(pai)幹(gan)，如此重復(fu)5次(ci)。若(ruo)使(shi)用(yong)自(zi)動(dong)洗板機，請(qing)按洗板機操(cao)作(zuo)程序進(jin)行(xing)洗板，添加浸泡(pao)30s的(de)程序，可(ke)以(yi)提(ti)高檢(jian)測的(de)精度(du)。洗板結(jie)束，加(jia)底物前，要在(zai)幹(gan)凈不掉(diao)屑的(de)紙上，充(chong)分(fen)拍(pai)幹(gan)反應板。

6、 將底(di)物A和(he)B按(an)1:1體(ti)積(ji)充(chong)分(fen)混合，所有(you)孔中加(jia)入(ru)底物混合液100μL。用(yong)封(feng)板膜(mo)蓋(gai)住反應板，37℃水浴鍋(guo)或恒(heng)溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育15min。

7、 所(suo)有孔加入(ru)終止液50μL，在酶(mei)標儀上讀取(qu)各(ge)孔吸光(guang)度(du)（OD值）。

結(jie)果計(ji)算(suan)

1、 以(yi)標(biao)準(zhun)品濃度(du)做為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，對(dui)應的(de)吸光(guang)度(du)（OD值）作(zuo)為縱(zong)坐標(biao)，利(li)用(yong)計(ji)算(suan)機軟(ruan)件，采(cai)用(yong)四(si)參數Logistic曲線擬(ni)合（4-pl），創建標(biao)準(zhun)曲線方(fang)程，通過樣本的(de)吸光(guang)度(du)（OD值），利(li)用(yong)方(fang)程計(ji)算(suan)樣品(pin)的(de)濃度(du)值。

2、 如果樣品(pin)被稀(xi)釋(shi)，通過上述方(fang)法測(ce)的(de)濃度(du)值，要乘(cheng)以(yi)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數，才是(shi)樣品(pin)的(de)最終濃度(du)。

試(shi)劑(ji)盒性(xing)能(neng)指標

1、物理性能(neng)

試(shi)劑(ji)盒的(de)各(ge)液體組(zu)分(fen)應澄(cheng)清透(tou)明(ming)、無(wu)沈澱(dian)或者絮(xu)狀(zhuang)物。微(wei)孔板鋁(lv)箔(bo)袋應真(zhen)空(kong)包(bao)裝(zhuang)，無(wu)破損(sun)漏(lou)氣。

2、劑(ji)量(liang)反應曲線線性(xing)

校準(zhun)品劑(ji)量(liang)反應曲線相(xiang)關(guan)系(xi)數r值，大(da)於等(deng)於0.9900。

3、精密(mi)度(du)

批內(nei)精密(mi)度(du)：三組(zu)已知(zhi)的(de)高、中(zhong)、低濃度(du)樣品(pin)，進行(xing)二十次在(zai)同(tong)壹(yi)個(ge)板塊(kuai)內(nei)精度(du)評估。批內(nei)變異(yi)系(xi)數CV%小(xiao)於10%。

批(pi)間(jian)精密(mi)度(du)：三組(zu)已知(zhi)的(de)高、中(zhong)、低濃度(du)樣品(pin)，進行(xing)二十次在(zai)不(bu)同(tong)板塊(kuai)內(nei)精度(du)評估。批間(jian)變異(yi)系(xi)數CV%小(xiao)於15%。

4、靈敏度(du)

檢出(chu)劑(ji)量(liang)小(xiao)於0.1 ng/mL。

5、回收率

三組(zu)已知(zhi)的(de)高、中(zhong)、低濃度(du)樣品(pin)，進行(xing)五(wu)次在同(tong)壹(yi)個(ge)板塊(kuai)內(nei)回收率評(ping)估，回收率在(zai)85%-115%之(zhi)間(jian)。

6、特(te)異(yi)性(xing)

本試(shi)劑(ji)盒識(shi)別(bie)天然(ran)和(he)重組S-腺(xian)苷甲硫(liu)氨酸（SAM），與結(jie)構類(lei)似物無(wu)交(jiao)叉。

7、穩定性

2℃-8℃保存(cun)，有(you)效期(qi)6個(ge)月。

8、 檢測(ce)範(fan)圍

3.75 ng/mL - 120 ng/mL