小鼠（LEP）ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)關(guan)於瘦(shou)素含量檢(jian)測(ce)原(yuan)理

小鼠（LEP）ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)關(guan)於瘦(shou)素含量檢(jian)測(ce)原(yuan)理

實驗原(yuan)理：

試劑(ji)盒(he)采(cai)用雙(shuang)抗體壹(yi)步(bu)夾(jia)心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往(wang)預(yu)先(xian)包(bao)被(bei)小鼠瘦(shou)素（LEP）捕(bu)獲(huo)抗體的(de)包(bao)被(bei)微(wei)孔中(zhong)，依(yi)次加入(ru)標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)檢測(ce)抗體，經(jing)過(guo)溫(wen)育(yu)並(bing)洗(xi)滌。用底(di)物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過(guo)氧(yang)化物酶的催化下(xia)轉化成藍色，並(bing)在酸的作(zuo)用下(xia)轉化成最終(zhong)的(de)黃(huang)色。顏(yan)色的(de)深淺和(he)樣(yang)品(pin)中(zhong)的小鼠瘦(shou)素（LEP）呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關(guan)。用酶標(biao)儀在450nm 波(bo)長下(xia)測(ce)定吸(xi)光(guang)度(du)（OD 值），計算樣品(pin)濃(nong)度(du)。

樣(yang)本(ben)處(chu)理及要(yao)求(qiu)：

1.  血清：將(jiang)收集於血(xue)清分(fen)離(li)管的全血(xue)標(biao)本在室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi)2小時(shi)或(huo)4℃過(guo)夜(ye)，然(ran)後(hou)1000×g離(li)心20 分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)即(ji)可(ke)，或(huo)將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

2.  血(xue)漿(jiang)：用EDTA或(huo)肝(gan)素作(zuo)為抗凝劑(ji)采(cai)集標(biao)本，並(bing)將(jiang)標(biao)本在采(cai)集後(hou)的30分(fen)鐘(zhong)內(nei)於2-8℃ 1000×g離(li)心15分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)，或將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

3.  組(zu)織勻(yun)漿(jiang)：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗(xi)組織，去除(chu)殘(can)留血(xue)液(ye)（勻漿中(zhong)裂解的紅細胞會影響(xiang)測(ce)量結果(guo)），稱重(zhong)後(hou)將(jiang)組織剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪碎的組(zu)織與(yu)對(dui)應體積(ji)的PBS（壹般(ban)按1:9的(de)重量(liang)體積(ji)比(bi)，比(bi)如(ru)1g的(de)組織樣(yang)品(pin)對(dui)應9mL的(de)PBS，具體體積(ji)可(ke)根(gen)據實(shi)驗需(xu)要(yao)適(shi)當(dang)調(tiao)整(zheng)，並(bing)做(zuo)好(hao)記(ji)錄。推(tui)薦(jian)在PBS中(zhong)加入蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)）加(jia)入玻璃勻(yun)漿(jiang)器(qi)中(zhong)，於冰(bing)上充(chong)分(fen)研磨(mo)。為了(le)進(jin)壹步(bu)裂(lie)解組織細胞，可(ke)以(yi)對(dui)勻漿(jiang)液(ye)進(jin)行超(chao)聲破碎(sui)，或反(fan)復(fu)凍融。最後(hou)將(jiang)勻漿液於5000×g離(li)心5~10分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)檢測(ce)。

4.  細胞培(pei)養物上清(qing)或其它(ta)生(sheng)物(wu)標(biao)本：請(qing)1000×g離(li)心20分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)，或將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

註(zhu)：標(biao)本溶(rong)血會影響(xiang)最後(hou)檢測(ce)結果(guo)，因(yin)此(ci)溶(rong)血標(biao)本不(bu)宜(yi)進(jin)行此(ci)項(xiang)檢(jian)測(ce)。

需要(yao)而(er)未(wei)提供(gong)的試(shi)劑(ji)和(he)器(qi)材：

1. 酶標(biao)儀（450nm）

2. 高精度(du)加(jia)樣(yang)器(qi)及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱(xiang)

4. 蒸餾(liu)水(shui)或去離(li)子水

試劑(ji)盒(he)組成(cheng)：

備註：

1.  標(biao)準品(pin)濃(nong)度(du)依(yi)次為：8、4、2、1、0.5、0.25 ng/mL

2.  經(jing)過(guo)大(da)量正(zheng)常(chang)標(biao)本檢(jian)驗，標(biao)本的(de)正(zheng)常(chang)濃(nong)度(du)值均(jun)在試(shi)劑(ji)盒(he)提供(gong)的(de)檢(jian)測(ce)範(fan)圍內，實(shi)驗過(guo)程(cheng)中(zhong)直(zhi)接取50μL樣本上樣(yang)即(ji)可(ke)。當(dang)有部(bu)分(fen)樣本(ben)值超過(guo)最大(da)標(biao)準品(pin)濃(nong)度(du)時(shi)，可(ke)用樣(yang)本(ben)稀(xi)釋(shi)液將(jiang)標(biao)本進(jin)行適(shi)當稀(xi)釋(shi)後(hou)再進(jin)行實(shi)驗。

註(zhu)意(yi)事項：

1. 嚴(yan)格(ge)按(an)照(zhao)規定(ding)的時(shi)間(jian)和(he)溫(wen)度(du)進(jin)行溫(wen)育(yu)以保(bao)證準確結果(guo)。所(suo)有(you)試劑(ji)都必須在使用前(qian)達到室(shi)溫20-25℃。使用後(hou)立(li)即(ji)冷藏保(bao)存(cun)試劑(ji)。

2. 洗(xi)板不(bu)正(zheng)確(que)可(ke)以(yi)導(dao)致(zhi)不(bu)準(zhun)確(que)的(de)結果(guo)。在加(jia)入(ru)底(di)物前(qian)確保(bao)盡量吸(xi)幹孔內液(ye)體。溫(wen)育(yu)過(guo)程(cheng)中(zhong)不要(yao)讓(rang)微(wei)孔幹燥掉。

3. 消(xiao)除(chu)板(ban)底(di)殘留的(de)液(ye)體和(he)手(shou)指印(yin)，否則影(ying)響(xiang)OD值。

4. 底(di)物顯(xian)色(se)液(ye)應呈(cheng)無(wu)色(se)或(huo)很淺的(de)顏(yan)色，已(yi)經變藍的(de)底(di)物液(ye)不(bu)能(neng)使用。

5. 避免試劑(ji)和(he)標(biao)本的(de)交叉汙(wu)染以免造成(cheng)錯誤結果(guo)。

6. 在儲存(cun)和(he)溫(wen)育(yu)時(shi)避免強光(guang)直(zhi)接照(zhao)射(she)。

7. 平衡(heng)至(zhi)室溫(wen)後(hou)再打(da)開(kai)密(mi)封(feng)袋以(yi)防水滴(di)凝聚(ju)在冷板條上。

8. 任(ren)何反應試(shi)劑(ji)不(bu)能接觸漂(piao)白(bai)溶(rong)劑(ji)或(huo)漂白(bai)溶(rong)劑(ji)所(suo)散(san)發(fa)的強烈(lie)氣體。任(ren)何漂白(bai)成(cheng)分(fen)都會破壞(huai)試(shi)劑(ji)盒(he)中(zhong)反應試(shi)劑(ji)的(de)生(sheng)物(wu)活(huo)性。

9. 不(bu)能使用過(guo)期產(chan)品(pin)。

10. 如(ru)果(guo)可(ke)能(neng)傳播(bo)疾病(bing)，所有(you)的樣品(pin)都應管(guan)理好(hao)，按(an)照(zhao)規定(ding)的程(cheng)序(xu)處(chu)理樣品(pin)和(he)檢(jian)測(ce)裝置。

試(shi)劑(ji)準(zhun)備：

試劑(ji)盒(he)從冷藏環(huan)境(jing)中(zhong)取出應在室(shi)溫(wen)平衡(heng)後(hou)方(fang)可(ke)使用。

20×洗(xi)滌緩沖(chong)液(ye)的(de)稀(xi)釋(shi)：蒸餾(liu)水(shui)按1：20稀(xi)釋(shi)，即(ji)1份(fen)20×洗(xi)滌緩沖(chong)液(ye)加(jia)19份(fen)蒸餾(liu)水(shui)。

操(cao)作步(bu)驟(zhou)：

1.  從室溫平衡(heng)20min後(hou)的鋁(lv)箔(bo)袋(dai)中(zhong)取出所需板條(tiao)，剩(sheng)余(yu)板(ban)條(tiao)用自(zi)封(feng)袋密(mi)封(feng)放(fang)回(hui)4℃。

2.  設(she)置標(biao)準品(pin)孔和(he)樣(yang)本孔，標(biao)準品(pin)孔各(ge)加(jia)不同(tong)濃(nong)度(du)的(de)標(biao)準品(pin)50μL；

3.  樣(yang)本孔中(zhong)加入待測(ce)樣本(ben)50μL；空(kong)白(bai)孔不加(jia)。

4.  除(chu)空(kong)白(bai)孔外，標(biao)準品(pin)孔和(he)樣(yang)本孔中(zhong)每孔加入(ru)辣(la)根過(guo)氧(yang)化物酶（HRP）標(biao)記的(de)檢測(ce)抗體100μL，用封(feng)板膜(mo)封(feng)住反應孔，37℃水浴(yu)鍋或恒(heng)溫箱(xiang)溫育(yu)60min。

5.  棄(qi)去液體，吸(xi)水紙上拍(pai)幹，每(mei)孔加滿洗(xi)滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌液(ye)，吸水紙上拍(pai)幹，如(ru)此(ci)重(zhong)復(fu)洗(xi)板5次（也可(ke)用洗(xi)板機(ji)洗(xi)板）。

6.  每(mei)孔加入(ru)底(di)物A、B各(ge)50μL，37℃避光(guang)孵(fu)育(yu)15min。

7.  每孔加入(ru)終止(zhi)液(ye)50μL，15min內(nei)，在450nm波(bo)長處(chu)測(ce)定各(ge)孔的OD值。

實驗結果(guo)：

以(yi)所(suo)測(ce)標(biao)準品(pin)的(de)OD值為橫(heng)坐標(biao)，標(biao)準品(pin)的(de)濃(nong)度(du)值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上或(huo)用相(xiang)關(guan)軟(ruan)件(jian)繪(hui)制標(biao)準曲(qu)線，並(bing)得(de)到直(zhi)線(xian)回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)，將(jiang)樣品(pin)的(de)OD值代(dai)入方(fang)程(cheng)，計(ji)算出樣品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。

試(shi)劑(ji)盒(he)性能(neng)：

1.  檢測(ce)範(fan)圍：0.25 ng/mL – 8 ng/mL。

2.  靈(ling)敏度(du)：檢(jian)測(ce)濃(nong)度(du)小於0.1 ng/mL。

3.  特(te)異性：不(bu)與(yu)其它(ta)可(ke)溶(rong)性結構類(lei)似物(wu)交叉反(fan)應。

4.  重(zhong)復(fu)性：板(ban)內變異系數(shu)小於10% ，板(ban)間變異系數(shu)小於15%  。