Mouse IL-33 ELISA Kit操(cao)作(zuo)方(fang)法(fa)

小(xiao)鼠(shu)白(bai)細(xi)胞介素(su)33（IL-33）試劑(ji)盒（ELISA）

使用(yong)說(shuo)明(ming)書(shu)

l 本(ben)試劑(ji)盒用(yong)於體(ti)外定量檢(jian)測(ce)血清(qing)、血(xue)漿(jiang)、組織(zhi)勻(yun)漿及(ji)相關(guan)液(ye)體(ti)樣本(ben)中(zhong)小(xiao)鼠(shu)白(bai)細(xi)胞介素(su)33（IL-33）的(de)含量。

l 有(you)效期：6個(ge)月(yue)

l 保(bao)存條件(jian)：2-8℃

l 本試劑(ji)盒僅(jin)供(gong)科研(yan)使用(yong)，不得用(yong)於臨床(chuang)診(zhen)斷(duan)

實(shi)驗(yan)原理

試劑(ji)盒采用(yong)雙抗(kang)體(ti)壹(yi)步(bu)夾(jia)心法酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸附(fu)試驗(yan)（ELISA）。往預先(xian)包被(bei)小(xiao)鼠(shu)白(bai)細(xi)胞介素(su)33（IL-33）捕獲抗體(ti)的包(bao)被(bei)微(wei)孔(kong)中，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)標(biao)本(ben)、標(biao)準(zhun)品(pin)、HRP標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗體(ti)，經過(guo)溫(wen)育(yu)並洗(xi)滌(di)。用(yong)底物(wu)TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧化(hua)物(wu)酶的(de)催(cui)化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)藍(lan)色(se)，並在酸(suan)的(de)作(zuo)用(yong)下轉(zhuan)化(hua)成(cheng)最(zui)終(zhong)的黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的深淺(qian)和樣品(pin)中(zhong)的(de)小(xiao)鼠(shu)白(bai)細(xi)胞介素(su)33（IL-33）呈正相關(guan)。用(yong)酶標(biao)儀(yi)在450nm 波長下(xia)測(ce)定吸光(guang)度(du)（OD 值(zhi)），計(ji)算(suan)樣品(pin)濃(nong)度(du)。

樣本(ben)處(chu)理及(ji)要(yao)求

1.  血(xue)清(qing)：將收集於血(xue)清(qing)分離管的全血(xue)標(biao)本(ben)在室溫放(fang)置2小(xiao)時(shi)或4℃過(guo)夜(ye)，然後(hou)1000×g離心20 分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可，或將上(shang)清(qing)置於-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應(ying)避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong)。
2.  血(xue)漿(jiang)：用(yong)EDTA或肝(gan)素(su)作(zuo)為(wei)抗(kang)凝(ning)劑(ji)采集(ji)標(biao)本(ben)，並(bing)將標(biao)本(ben)在采集(ji)後的(de)30分鐘內於2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢(jian)測(ce)，或將上(shang)清(qing)置於-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應(ying)避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong)。
3.  組織(zhi)勻(yun)漿：用(yong)預冷(leng)的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗(xi)組織(zhi)，去(qu)除殘(can)留血液(ye)（勻(yun)漿中裂(lie)解(jie)的紅(hong)細(xi)胞會(hui)影響測(ce)量結果(guo)），稱(cheng)重後(hou)將組織(zhi)剪(jian)碎(sui)。將剪(jian)碎的(de)組織(zhi)與(yu)對應(ying)體(ti)積的PBS（壹(yi)般按1:9的(de)重量(liang)體(ti)積比，比(bi)如1g的(de)組織(zhi)樣品(pin)對應(ying)9mL的(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積可根據(ju)實(shi)驗(yan)需要(yao)適(shi)當(dang)調(tiao)整，並做好記(ji)錄(lu)。推(tui)薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)）加(jia)入(ru)玻璃勻(yun)漿器中，於冰(bing)上(shang)充分研(yan)磨。為了(le)進(jin)壹(yi)步(bu)裂(lie)解(jie)組織(zhi)細(xi)胞，可以(yi)對勻(yun)漿液(ye)進(jin)行超聲(sheng)破碎，或反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。最(zui)後(hou)將勻(yun)漿液(ye)於5000×g離(li)心5~10分鐘，取上(shang)清(qing)檢(jian)測(ce)。

4.  細(xi)胞培養(yang)物(wu)上清(qing)或其(qi)它(ta)生(sheng)物(wu)標(biao)本(ben)：請1000×g離心20分鐘，取上(shang)清(qing)即(ji)可檢(jian)測(ce)，或將上(shang)清(qing)置於-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應(ying)避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong)。

註(zhu)：標(biao)本(ben)溶血會(hui)影響最(zui)後(hou)檢(jian)測(ce)結果(guo)，因(yin)此溶血標(biao)本(ben)不宜進(jin)行此項(xiang)檢(jian)測(ce)。

需要(yao)而(er)未提供(gong)的(de)試劑(ji)和器材

1. 酶標(biao)儀(yi)（450nm）

2. 高精度(du)加(jia)樣器(qi)及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫(wen)箱(xiang)

4. 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或去(qu)離子水(shui)

試劑(ji)盒組成(cheng)

備註：

1.  標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度(du)依(yi)次(ci)為(wei)：160、80、40、20、10、5 pg/mL

2.  經過(guo)大量正常(chang)標(biao)本(ben)檢(jian)驗(yan)，標(biao)本(ben)的(de)正常(chang)濃度(du)值(zhi)均在試劑(ji)盒提供(gong)的(de)檢(jian)測(ce)範圍(wei)內，實(shi)驗(yan)過程(cheng)中(zhong)直(zhi)接取50μL樣本(ben)上(shang)樣即(ji)可。當有(you)部(bu)分樣本(ben)值(zhi)超過最(zui)大標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度(du)時(shi)，可用(yong)樣本(ben)稀(xi)釋液(ye)將標(biao)本(ben)進(jin)行適(shi)當稀(xi)釋後再進(jin)行實(shi)驗(yan)。

註意(yi)事項(xiang)

1. 嚴(yan)格(ge)按照(zhao)規定的時(shi)間和溫度(du)進(jin)行溫(wen)育以(yi)保(bao)證準(zhun)確(que)結果(guo)。所(suo)有(you)試劑(ji)都必(bi)須(xu)在使用(yong)前(qian)達(da)到(dao)室(shi)溫(wen)20-25℃。使用(yong)後立(li)即冷(leng)藏保(bao)存試劑(ji)。

2. 洗(xi)板(ban)不正確可以(yi)導致不準確(que)的(de)結果(guo)。在加(jia)入(ru)底物(wu)前(qian)確(que)保(bao)盡量(liang)吸(xi)幹孔(kong)內液(ye)體(ti)。溫育(yu)過(guo)程(cheng)中不要(yao)讓微孔(kong)幹燥掉(diao)。

3. 消除板底殘(can)留的液(ye)體(ti)和手指(zhi)印，否(fou)則(ze)影響OD值(zhi)。

4. 底物(wu)顯(xian)色(se)液(ye)應呈無(wu)色(se)或很(hen)淺(qian)的顏(yan)色(se)，已經(jing)變藍(lan)的底物(wu)液(ye)不能使用(yong)。

5. 避免(mian)試劑(ji)和標(biao)本(ben)的(de)交(jiao)叉(cha)汙染(ran)以(yi)免(mian)造(zao)成(cheng)錯(cuo)誤(wu)結果(guo)。

6. 在儲存和溫育時避(bi)免(mian)強(qiang)光直(zhi)接(jie)照射。

7. 平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫(wen)後(hou)再打開(kai)密(mi)封袋(dai)以(yi)防(fang)水(shui)滴凝(ning)聚(ju)在冷板條上(shang)。

8. 任何反應(ying)試劑(ji)不能接(jie)觸漂(piao)白溶劑(ji)或漂(piao)白溶劑(ji)所(suo)散(san)發的強(qiang)烈(lie)氣體(ti)。任何漂白(bai)成分都會(hui)破壞(huai)試劑(ji)盒中(zhong)反應(ying)試劑(ji)的生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)。

9. 不能使用(yong)過期產(chan)品(pin)。

10. 如(ru)果(guo)可能傳(chuan)播疾病(bing)，所(suo)有(you)的樣品(pin)都應(ying)管(guan)理好(hao)，按照(zhao)規定的程(cheng)序處(chu)理樣品(pin)和檢(jian)測(ce)裝(zhuang)置。

試劑(ji)準備(bei)

試劑(ji)盒從(cong)冷藏環(huan)境中取出(chu)應在室溫平(ping)衡後方(fang)可使用(yong)。

20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按1：20稀(xi)釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)加(jia)19份蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)

1.  從(cong)室溫平衡20min後的鋁箔(bo)袋(dai)中(zhong)取出(chu)所(suo)需板條，剩(sheng)余板條用(yong)自封(feng)袋(dai)密(mi)封(feng)放(fang)回4℃。

2.  設(she)置標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)各加(jia)不同濃(nong)度(du)的(de)標(biao)準(zhun)品(pin)50μL；

3.  樣本(ben)孔(kong)中加(jia)入(ru)待測(ce)樣本(ben)50μL；空(kong)白(bai)孔(kong)不加(jia)。

4.  除空白孔(kong)外，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)中每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)辣根過氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗體(ti)100μL，用(yong)封板(ban)膜封(feng)住反應孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋(guo)或恒(heng)溫箱溫育60min。

5.  棄(qi)去(qu)液(ye)體(ti)，吸水(shui)紙(zhi)上拍(pai)幹，每(mei)孔(kong)加(jia)滿洗(xi)滌(di)液(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗(xi)滌(di)液(ye)，吸水(shui)紙(zhi)上拍(pai)幹，如此重(zhong)復(fu)洗(xi)板(ban)5次(ci)（也(ye)可用(yong)洗(xi)板(ban)機洗(xi)板(ban)）。

6.  每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)底物(wu)A、B各50μL，37℃避(bi)光(guang)孵育(yu)15min。

7.  每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)終止液(ye)50μL，15min內，在450nm波長處(chu)測(ce)定各孔(kong)的OD值(zhi)。

實(shi)驗(yan)結果(guo)計(ji)算(suan)

以(yi)所(suo)測(ce)標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)OD值(zhi)為橫(heng)坐標(biao)，標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)濃度(du)值(zhi)為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐標(biao)紙(zhi)上或用(yong)相關(guan)軟(ruan)件(jian)繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線，並(bing)得到(dao)直(zhi)線(xian)回歸(gui)方(fang)程(cheng)，將樣品(pin)的(de)OD值(zhi)代入(ru)方(fang)程(cheng)，計(ji)算(suan)出(chu)樣品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。

試劑(ji)盒性(xing)能

1.  檢(jian)測(ce)範圍(wei)：5 pg/mL – 160 pg/mL。

2.  靈(ling)敏(min)度(du)：檢(jian)測(ce)濃度(du)小(xiao)於1.0 pg/mL。

3.  特(te)異(yi)性(xing)：不與(yu)其(qi)它(ta)可溶性(xing)結構類似(si)物(wu)交(jiao)叉(cha)反應(ying)。

4.  重復(fu)性(xing)：板(ban)內變異(yi)系數(shu)小(xiao)於10% ，板(ban)間(jian)變異(yi)系數(shu)小(xiao)於15% 。