人(ren)α澱粉(fen)酶（AMS）ELISA試(shi)劑盒(he)使(shi)用(yong)說明(ming)書

人(ren)α澱粉(fen)酶（AMS）試(shi)劑(ji)盒(he)（ELISA）

使(shi)用(yong)說明(ming)書

 l  本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)用(yong)於體(ti)外(wai)定量檢測(ce)血(xue)清(qing)、血漿、組(zu)織勻漿(jiang)及(ji)相(xiang)關液(ye)體(ti)樣(yang)本中(zhong)人(ren)α澱粉(fen)酶（AMS）的(de)含量。

l  有(you)效期(qi)：6個(ge)月(yue)

l  保(bao)存(cun)條件(jian)：2-8℃

l  本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)僅(jin)供體(ti)外(wai)研究使用(yong)，不用(yong)於臨(lin)床(chuang)診斷

實(shi)驗(yan)原(yuan)理(li)

試(shi)劑(ji)盒(he)采(cai)用(yong)雙抗(kang)體(ti)壹步(bu)夾心法酶聯(lian)免疫吸(xi)附試(shi)驗(yan)（ELISA）。往(wang)預(yu)先包(bao)被(bei)人(ren)α澱粉(fen)酶（AMS）捕獲(huo)抗(kang)體(ti)的(de)包(bao)被微孔(kong)中，依次加(jia)入標(biao)本(ben)、標(biao)準(zhun)品、HRP標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)，經(jing)過(guo)溫(wen)育並(bing)*洗滌(di)。用(yong)底物(wu)TMB顯(xian)色，TMB在過(guo)氧(yang)化物(wu)酶的(de)催(cui)化下轉化成(cheng)藍色，並(bing)在(zai)酸(suan)的作(zuo)用(yong)下轉化成(cheng)zui終的黃色。顏(yan)色的深淺和(he)樣(yang)品中的人(ren)α澱粉(fen)酶（AMS）呈正(zheng)相(xiang)關。用(yong)酶標(biao)儀在(zai)450nm 波(bo)長下測(ce)定(ding)吸(xi)光度(du)（OD 值(zhi)），計(ji)算樣(yang)品濃度(du)。
樣(yang)本處(chu)理(li)及(ji)要(yao)求(qiu)

1.  血(xue)清(qing)：將(jiang)收集(ji)於(yu)血(xue)清(qing)分離(li)管的(de)全(quan)血標(biao)本(ben)在(zai)室(shi)溫(wen)放置(zhi)2小(xiao)時(shi)或(huo)4℃放置(zhi)壹夜(ye)，然(ran)後(hou)1000×g離(li)心20 分鐘，取上清(qing)即可，或(huo)將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免反復凍融(rong)。
2.  血(xue)漿(jiang)：用(yong)EDTA或(huo)肝素作(zuo)為抗(kang)凝(ning)劑(ji)采(cai)集標(biao)本(ben)，並(bing)將(jiang)標(biao)本(ben)在(zai)采(cai)集(ji)後(hou)的30分鐘內於(yu)2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取上清(qing)即可檢(jian)測(ce)，或(huo)將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免反復凍融(rong)。
3.  組(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)：用(yong)預(yu)冷(leng)的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)，去(qu)除(chu)殘(can)留血液（勻漿中(zhong)裂(lie)解的(de)紅(hong)細(xi)胞(bao)會(hui)影(ying)響(xiang)測(ce)量結(jie)果），稱重(zhong)後(hou)將(jiang)組織剪碎。將(jiang)剪碎的(de)組(zu)織與對(dui)應體(ti)積(ji)的PBS（壹般(ban)按(an)1:9的(de)重(zhong)量體(ti)積(ji)比，比如1g的(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)品對(dui)應9mL的(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積(ji)可根(gen)據實(shi)驗(yan)需(xu)要(yao)適(shi)當(dang)調(tiao)整，並(bing)做(zuo)好記錄。推薦(jian)在PBS中(zhong)加(jia)入蛋(dan)白酶抑(yi)制劑(ji)）加入玻璃(li)勻漿(jiang)器中，於(yu)冰上(shang)充分研磨。為了(le)進壹步(bu)裂(lie)解組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)，可以(yi)對(dui)勻漿(jiang)液進行超(chao)聲(sheng)破(po)碎(sui)，或(huo)反復凍融(rong)。zui後(hou)將(jiang)勻漿液(ye)於5000×g離(li)心5~10分鐘，取上清(qing)檢測(ce)。

4.  細(xi)胞(bao)培養(yang)物(wu)上清(qing)或其它生物(wu)標(biao)本(ben)：請1000×g離(li)心20分鐘，取上清(qing)即可檢(jian)測(ce)，或(huo)將(jiang)上清(qing)置於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免反復凍融(rong)。

註：標(biao)本(ben)溶(rong)血(xue)會(hui)影響(xiang)zui後(hou)檢測(ce)結(jie)果，因(yin)此溶血標(biao)本(ben)不宜(yi)進行此項檢測(ce)。

需(xu)要(yao)而(er)未(wei)提供的(de)試劑(ji)和(he)器材(cai)

1. 酶(mei)標(biao)儀（450nm）
2. 高精度(du)加樣(yang)器及(ji)槍(qiang)頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒(heng)溫(wen)箱(xiang)
4. 蒸餾水或去(qu)離(li)子水

試(shi)劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)

備(bei)註：

1.  標(biao)準(zhun)品濃度(du)依次為(wei)：80、40、20、10、5、2.5 ng/mL

2.  經(jing)過(guo)大(da)量正(zheng)常(chang)標(biao)本(ben)檢(jian)驗(yan)，標(biao)本(ben)的(de)正(zheng)常(chang)濃度(du)值(zhi)均(jun)在(zai)試(shi)劑盒提供的(de)檢測(ce)範圍內，實(shi)驗(yan)過(guo)程(cheng)中(zhong)直接取50μL樣(yang)本上(shang)樣(yang)即可。當(dang)有(you)部(bu)分樣(yang)本值(zhi)超(chao)過(guo)zui大(da)標(biao)準(zhun)品濃度(du)時，可用(yong)樣(yang)本稀釋液(ye)將(jiang)標(biao)本(ben)進行適(shi)當(dang)稀釋後(hou)再(zai)進行實(shi)驗(yan)。

註意事(shi)項(xiang)

1. 嚴(yan)格按(an)照(zhao)規定的(de)時(shi)間(jian)和(he)溫(wen)度(du)進行溫(wen)育以(yi)保(bao)證(zheng)準(zhun)確(que)結(jie)果。所(suo)有(you)試劑(ji)都(dou)必須(xu)在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)達到室(shi)溫(wen)20-25℃。使(shi)用(yong)後(hou)立即冷(leng)藏(zang)保存(cun)試劑(ji)。
2. 洗板(ban)不正(zheng)確(que)可以(yi)導致不準(zhun)確(que)的結(jie)果。在加(jia)入底物(wu)前(qian)確保(bao)盡量吸(xi)幹(gan)孔(kong)內液(ye)體(ti)。溫(wen)育過(guo)程(cheng)中(zhong)不要(yao)讓微孔(kong)幹(gan)燥(zao)掉(diao)。
3. 消(xiao)除(chu)板(ban)底殘(can)留的液體(ti)和(he)手指印(yin)，否(fou)則(ze)影響(xiang)OD值(zhi)。
4. 底物(wu)顯(xian)色液應呈無(wu)色或很淺的(de)顏(yan)色，已經(jing)變(bian)藍的底物(wu)液不能(neng)使用(yong)。
5. 避(bi)免(mian)試(shi)劑(ji)和(he)標(biao)本(ben)的(de)交叉(cha)汙(wu)染(ran)以(yi)免(mian)造(zao)成(cheng)錯誤結(jie)果。
6. 在(zai)儲(chu)存(cun)和(he)溫(wen)育時(shi)避(bi)免強光直接照射(she)。
7. 平衡(heng)至(zhi)室(shi)溫(wen)後(hou)再(zai)打(da)開(kai)密(mi)封袋(dai)以(yi)防水滴(di)凝聚(ju)在冷(leng)板條(tiao)上。
8. 任何反應試劑不能(neng)接觸(chu)漂白溶劑(ji)或(huo)漂白溶劑(ji)所(suo)散發的強烈(lie)氣體(ti)。任何漂白成(cheng)分都(dou)會破(po)壞(huai)試劑(ji)盒中(zhong)反應試劑的生(sheng)物(wu)活(huo)性。
9. 不能(neng)使用(yong)過(guo)期(qi)產品。
10. 如(ru)果(guo)可能(neng)傳播(bo)疾(ji)病，所(suo)有(you)的樣(yang)品都(dou)應管理(li)好，按(an)照規定的(de)程(cheng)序(xu)處(chu)理(li)樣(yang)品和(he)檢測(ce)裝(zhuang)置(zhi)。

試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)

試(shi)劑(ji)盒(he)從(cong)冷(leng)藏(zang)環(huan)境(jing)中(zhong)取(qu)出(chu)應(ying)在室(shi)溫(wen)平衡(heng)後(hou)方可使(shi)用(yong)。

20×洗滌(di)緩沖(chong)液(ye)的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即(ji)1份(fen)20×洗滌(di)緩沖(chong)液(ye)加19份(fen)蒸餾水。

操作(zuo)步驟(zhou)

1.   從(cong)室(shi)溫(wen)平衡(heng)20min後(hou)的鋁箔(bo)袋(dai)中取(qu)出(chu)所(suo)需(xu)板(ban)條(tiao)，剩余板條用(yong)自封袋(dai)密(mi)封放回(hui)4℃。
2.   設(she)置標(biao)準(zhun)品孔(kong)和(he)樣(yang)本孔(kong)，標(biao)準(zhun)品孔(kong)各加不同濃度(du)的標(biao)準(zhun)品50μL；
3.   樣(yang)本孔(kong)中加入待(dai)測(ce)樣(yang)本50μL；空(kong)白孔(kong)不加(jia)。
4.  除(chu)空(kong)白孔(kong)外(wai)，標(biao)準(zhun)品孔(kong)和(he)樣(yang)本孔(kong)中每孔(kong)加入辣(la)根(gen)過(guo)氧(yang)化物(wu)酶（HRP）標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)100μL，用(yong)封板(ban)膜(mo)封住(zhu)反應孔(kong)，37℃水浴鍋(guo)或(huo)恒(heng)溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育60min。
5.   棄(qi)去(qu)液體(ti)，吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，每孔(kong)加滿洗滌(di)液（350μL），靜(jing)置1min，甩去(qu)洗滌(di)液，吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，如(ru)此重(zhong)復洗板(ban)5次（也可用(yong)洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。
6.   每孔(kong)加入底物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避(bi)光孵育15min。
7.   每孔(kong)加入終止液(ye)50μL，15min內，在(zai)450nm波(bo)長處(chu)測(ce)定(ding)各(ge)孔(kong)的OD值(zhi)。

實(shi)驗(yan)結(jie)果計算

以(yi)所(suo)測(ce)標(biao)準(zhun)品的OD值(zhi)為(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)，標(biao)準(zhun)品的濃度(du)值(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在(zai)坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上(shang)或用(yong)相關軟件(jian)繪(hui)制標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)，並(bing)得(de)到直線(xian)回歸(gui)方程，將(jiang)樣(yang)品的OD值(zhi)代入方程，計算出(chu)樣(yang)品的濃度(du)。

試(shi)盒(he)性能(neng)

1.  檢(jian)測(ce)範圍：2.5 ng/mL – 80 ng/mL。

2.  靈(ling)敏度(du)：zui低檢(jian)測(ce)濃度(du)小於(yu)0.1 ng/mL。

3.  特(te)異(yi)性：不與(yu)其(qi)它可溶(rong)性結(jie)構類(lei)似(si)物(wu)交叉(cha)反應。

4.  重(zhong)復性：板內變(bian)異系(xi)數(shu)小(xiao)於(yu)10% ，板(ban)間(jian)變異(yi)系(xi)數(shu)小(xiao)於(yu)15% 。

說(shuo)明(ming)

1. 由(you)於(yu)現(xian)有(you)條件(jian)及(ji)科(ke)學(xue)技(ji)術(shu)水平尚(shang)不能(neng)對(dui)所(suo)有(you)供貨商(shang)提供的(de)所(suo)有(you)原(yuan)料進行全(quan)面(mian)的鑒(jian)定與分析(xi)，本產(chan)品可能(neng)存(cun)在壹定(ding)的質(zhi)量技(ji)術(shu)風險(xian)。
2. zui終的實(shi)驗(yan)結(jie)果與試(shi)劑(ji)的有(you)效性、實(shi)驗(yan)者的相關操作(zuo)以(yi)及(ji)當(dang)時(shi)的實(shi)驗(yan)環(huan)境(jing)密(mi)切相(xiang)關，請務(wu)必(bi)準備(bei)充足(zu)的標(biao)本(ben)備(bei)份(fen)。
3. 不同批(pi)次的(de)同壹產(chan)品可能(neng)會有(you)少(shao)許差別(bie)，如：檢測(ce)限、靈(ling)敏度(du)以(yi)及(ji)顯(xian)色時間(jian)等，請依(yi)據(ju)試劑(ji)盒內說(shuo)明(ming)書進行實(shi)驗(yan)操作(zuo)，電(dian)子版(ban)說明(ming)書僅(jin)作(zuo)參考(kao)。
4. 只(zhi)有(you)全部(bu)使用(yong)本試(shi)劑(ji)盒配(pei)套試劑才能(neng)保證(zheng)檢測(ce)效(xiao)果(guo)，不能(neng)混用(yong)其他(ta)制造(zao)商的產品。只有(you)嚴格遵(zun)守本試劑盒(he)的(de)實(shi)驗(yan)說(shuo)明(ming)才會(hui)得(de)到(dao)*的檢(jian)測(ce)結(jie)果。