植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS）酶(mei)聯(lian)免疫分析(xi)（ELISA）說明(ming)書

本(ben)試(shi)劑僅(jin)供研(yan)究(jiu)使(shi)用      目的：本試(shi)劑盒(he)用於(yu)測定植物(wu)組織(zhi)等(deng)相(xiang)關液體樣本(ben)中(zhong)抗性澱(dian)粉（RS）的含量(liang)。

實(shi)驗(yan)原(yuan)理(li)：

本(ben)試(shi)劑盒(he)應用雙抗體(ti)夾(jia)心(xin)法(fa)測定標(biao)本中(zhong)植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS）水(shui)平。用純(chun)化的植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS）捕獲抗體包被(bei)微(wei)孔板(ban)，制成固相(xiang)抗體(ti)，往包被(bei)的微(wei)孔中(zhong)依(yi)次加(jia)入(ru)植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS），再(zai)與(yu)HRP標(biao)記(ji)的檢(jian)測抗(kang)體結(jie)合(he)，形成抗體(ti)-抗原(yuan)-酶(mei)標(biao)抗(kang)體(ti)復合(he)物，經(jing)過*洗(xi)滌後(hou)加(jia)底(di)物(wu)TMB顯色。TMB在HRP酶(mei)的催(cui)化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成藍(lan)色，並在酸(suan)的作用下(xia)轉(zhuan)化(hua)成zui終的黃色。顏(yan)色的深(shen)淺(qian)和(he)樣(yang)品(pin)中(zhong)的植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS）呈正(zheng)相(xiang)關。用酶(mei)標(biao)儀(yi)在450nm波長(chang)下(xia)測定吸光(guang)度（OD值），通過標準曲線計(ji)算樣品(pin)中(zhong)植物(wu)抗性澱(dian)粉（RS）含(han)量(liang)。

試(shi)劑盒(he)組成：

註(zhu)：標準品濃度依(yi)次為：640、320、160、80、40、0 μg/mL.

樣(yang)本處理(li)及(ji)要求：

1. 血清：室(shi)溫血液自然凝(ning)固(gu)10-20分(fen)鐘(zhong)，離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過程(cheng)中(zhong)如出(chu)現沈(chen)澱(dian)，應再次(ci)離(li)心。

2. 血漿：應根據(ju)標(biao)本的要求選擇(ze)EDTA或(huo)檸(ning)檬(meng)酸(suan)鈉(na)作(zuo)為抗凝劑，混合(he)10-20分鐘(zhong)後(hou)，離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過程(cheng)中(zhong)如有沈(chen)澱(dian)形成，應該再(zai)次離心(xin)。

3. 尿(niao)液：用無(wu)菌管(guan)收集(ji)，離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清，保存(cun)過程(cheng)中(zhong)如有沈(chen)澱(dian)形成，應再次(ci)離(li)心。胸腹(fu)水(shui)、腦(nao)脊液參照(zhao)實(shi)行(xing)。

4. 細(xi)胞(bao)培(pei)養上(shang)清：檢(jian)測分泌(mi)性的成份時，用無(wu)菌管(guan)收集(ji)。離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清。檢(jian)測細(xi)胞(bao)內(nei)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xi)胞(bao)懸(xuan)液，細(xi)胞(bao)濃(nong)度達(da)到100萬(wan)/ml左(zuo)右。通過反(fan)復凍(dong)融，以(yi)使(shi)細(xi)胞(bao)破(po)壞(huai)並放(fang)出(chu)細(xi)胞(bao)內(nei)成份。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清。保存(cun)過程(cheng)中(zhong)如有沈(chen)澱(dian)形成，應再次(ci)離(li)心。

5. 組(zu)織標(biao)本：切(qie)割(ge)標(biao)本(ben)後(hou)，稱取(qu)重(zhong)量(liang)。加(jia)入(ru)壹(yi)定(ding)量(liang)的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍(dong)保存(cun)備用。標(biao)本融化(hua)後(hou)仍(reng)然(ran)保持(chi)2-8℃的溫度。加入壹(yi)定(ding)量(liang)的PBS（PH7.4），用手(shou)工(gong)或勻(yun)漿(jiang)器(qi)將(jiang)標本(ben)勻(yun)漿(jiang)充分。離心20分鐘(zhong)左(zuo)右（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細(xi)收集(ji)上(shang)清。分裝(zhuang)後(hou)壹(yi)份待檢(jian)測，其(qi)余冷凍(dong)備用。

6. 標(biao)本采集(ji)後(hou)盡早(zao)進行提取(qu)，提取(qu)按(an)相(xiang)關文(wen)獻(xian)進行，提取(qu)後(hou)應盡快進行實(shi)驗(yan)。若(ruo)不能(neng)馬(ma)上(shang)進行試(shi)驗(yan)，可(ke)將(jiang)標本(ben)放(fang)於(yu)-20℃保(bao)存，但應避(bi)免(mian)反(fan)復凍(dong)融.

7. 不能(neng)檢(jian)測含NaN3的樣品(pin)，因NaN3抑(yi)制(zhi)辣(la)根過(guo)氧(yang)化(hua)物(wu)酶(mei)的（HRP）活性。

操(cao)作步(bu)驟(zhou)

1. 標(biao)準品的加樣(yang)：設(she)置標準品孔和(he)樣(yang)本(ben)孔(kong)，標準品孔各加不同(tong)濃度的標準品50μL；。
2. 加(jia)樣：分(fen)別(bie)設(she)空(kong)白孔（空(kong)白對照(zhao)孔(kong)不加(jia)樣(yang)品及酶(mei)標(biao)試(shi)劑，其(qi)余各步(bu)操(cao)作相(xiang)同(tong)）、待(dai)測樣品(pin)孔。在酶(mei)標(biao)包被(bei)板(ban)上(shang)待(dai)測樣品(pin)孔中(zhong)先(xian)加樣品稀釋液40μl，然(ran)後(hou)再(zai)加(jia)待(dai)測樣品(pin)10μl（樣(yang)品zui終(zhong)稀釋度為5倍(bei)）。加(jia)樣將(jiang)樣品(pin)加(jia)於(yu)酶(mei)標(biao)板(ban)孔(kong)底(di)部，盡量(liang)不觸(chu)及(ji)孔壁(bi)，輕輕晃(huang)動(dong)混勻(yun)。
3. 溫(wen)育：用封(feng)板膜封(feng)板(ban)後(hou)置(zhi)37℃溫(wen)育30分(fen)鐘(zhong)。
4. 配(pei)液：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌液用蒸(zheng)餾水(shui)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀釋後(hou)備(bei)用。
5. 洗(xi)滌：小心揭(jie)掉(diao)封板膜，棄(qi)去(qu)液體，甩幹，每(mei)孔(kong)加滿(man)洗滌(di)液，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後(hou)棄(qi)去(qu)，如此(ci)重復5次，拍(pai)幹。
6. 加(jia)酶(mei)：每(mei)孔(kong)加入(ru)酶(mei)標(biao)試(shi)劑50μl，空(kong)白孔除(chu)外。
7. 溫(wen)育：操(cao)作(zuo)同(tong)3。
8. 洗(xi)滌：操(cao)作同(tong)5。
9. 顯色：每(mei)孔(kong)先(xian)加入顯色劑A50μl，再(zai)加入(ru)顯色劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩混勻(yun)，37℃避(bi)光(guang)顯色15分鐘(zhong).
10. 終(zhong)止：每(mei)孔(kong)加終(zhong)止液50μl，終止反(fan)應（此時藍(lan)色立(li)轉(zhuan)黃色）。
11. 測定：以(yi)空(kong)白空(kong)調零(ling)，450nm波長(chang)依(yi)序測量(liang)各(ge)孔(kong)的吸光(guang)度（OD值）。 測定應在加(jia)終(zhong)止液後(hou)15分(fen)鐘(zhong)以內(nei)進行。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)：

1. 試(shi)劑盒(he)從(cong)冷藏(zang)環境中(zhong)取(qu)出(chu)應在室(shi)溫平衡15-30分鐘(zhong)後(hou)方(fang)可(ke)使(shi)用，酶(mei)標(biao)包被(bei)板(ban)開(kai)封(feng)後(hou)如(ru)未(wei)用完(wan)，板條應裝入(ru)密(mi)封袋中(zhong)保存。
2. 濃(nong)洗滌(di)液可能會(hui)有結(jie)晶(jing)析(xi)出(chu)，稀釋時可(ke)在水(shui)浴(yu)中(zhong)加溫助(zhu)溶(rong)，洗滌(di)時不影(ying)響(xiang)結(jie)果(guo)。
3. 各(ge)步加(jia)樣均(jun)應使(shi)用加(jia)樣器(qi)，並經(jing)常校對(dui)其(qi)準確性，以避(bi)免(mian)試(shi)驗(yan)誤(wu)差(cha)。壹(yi)次(ci)加樣時間(jian)控制在5分(fen)鐘(zhong)內，如(ru)標本(ben)數(shu)量(liang)多(duo)，推(tui)薦(jian)使(shi)用排(pai)槍加樣(yang)。
4. 請(qing)每(mei)次(ci)測定的同(tong)時做標準曲線，做復孔。如(ru)標(biao)本中(zhong)待測物質含量(liang)過(guo)高(gao)（樣(yang)本OD值大於(yu)標(biao)準品孔*孔的OD值），請先(xian)用樣(yang)品稀釋液稀釋壹(yi)定(ding)倍(bei)數(shu)（n倍(bei)）後(hou)再(zai)測定，計(ji)算時請(qing)zui後(hou)乘(cheng)以(yi)總(zong)稀釋倍(bei)數(shu)（×n×5）。
5. 封(feng)板膜(mo)只限(xian)壹(yi)次(ci)性使(shi)用，以(yi)避(bi)免(mian)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染。
6. 底(di)物請(qing)避(bi)光(guang)保存。
7. 嚴(yan)格(ge)按(an)照(zhao)說(shuo)明(ming)書的操作(zuo)進行，試(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)判(pan)定必須(xu)以(yi)酶(mei)標(biao)儀(yi)讀數(shu)為準.
8. 所(suo)有樣品(pin)，洗滌(di)液和(he)各(ge)種(zhong)廢棄物(wu)都應按(an)傳(chuan)染物(wu)處理(li)。
9. 本(ben)試(shi)劑不同(tong)批號(hao)組(zu)分(fen)不得混用。 

10. 如(ru)與(yu)英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書有異，以英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書為準。

    計(ji)算：

    以(yi)標準物的濃度為橫坐(zuo)標(biao)，OD值為縱坐(zuo)標(biao)，   

    在坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上(shang)繪出(chu)標(biao)準曲線，根(gen)據樣(yang)品(pin)的OD     

    值由標準曲線查(zha)出(chu)相(xiang)應的濃度；再乘以稀釋     

    倍(bei)數(shu)；或(huo)用標(biao)準物的濃度與(yu)OD值計算出(chu)標(biao)     

    準曲線的直線(xian)回(hui)歸(gui)方(fang)程式，將(jiang)樣品(pin)的OD值     

    代(dai)入方(fang)程式，計算出(chu)樣(yang)品濃度，再乘以稀釋     

    倍(bei)數(shu)，即為樣品的實(shi)際(ji)濃度。                 

     

    試(shi)劑盒(he)性能：

    1.樣(yang)品線(xian)性回(hui)歸(gui)與(yu)預期(qi)濃度相(xiang)關系數(shu)R值為0.95以上(shang)。

    2.批內變異系數(shu)與(yu)批間變異系數(shu)應分別(bie)小於(yu)10%和(he)15% 。

    檢(jian)測範圍(wei)：                                              

    20 μg/mL - 640 μg/mL

    靈(ling)敏度：                                             

    zui低檢(jian)測濃度小於(yu)1.0 μg/mL

    保(bao)存條件(jian)及(ji)有效期(qi)：

    1.試(shi)劑盒(he)保存(cun)： 2-8℃。

    2．有效期(qi)： 6個(ge)月(yue)