小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）定量(liang)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒(he)（ELISA）說明書

僅供(gong)科(ke)研(yan)使用(yong)，不得(de)用(yong)於臨(lin)床診(zhen)斷

小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）定量(liang)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒(he)（ELISA）

定量(liang)檢(jian)測(ce)血清、血(xue)漿、細胞培(pei)養(yang)上(shang)清液(ye)中小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）的濃度(du)。

使用(yong)試劑(ji)盒(he)前，必(bi)須(xu)仔細(xi)閱(yue)讀(du)本說明書。

實驗(yan)原(yuan)理

本試劑(ji)盒(he)采用(yong)競爭(zheng)法(fa)酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附試驗(yan)（ELISA）。在預(yu)包(bao)被抗小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）抗體(ti)（固(gu)相抗體(ti)）的微(wei)孔(kong)酶(mei)標板(ban)中，加(jia)入(ru)小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）校(xiao)準(zhun)品(pin)和待(dai)測(ce)樣(yang)本，再(zai)加(jia)入(ru)HRP標記(ji)的小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）抗原(yuan)（酶(mei)標抗原(yuan)），經過(guo)溫(wen)育與充(chong)分(fen)洗滌，去(qu)除未結(jie)合(he)的組分(fen)，在微(wei)孔(kong)板(ban)固(gu)相表面(mian)形(xing)成(cheng)固(gu)相抗體(ti)-酶(mei)標抗原(yuan)的免(mian)疫復合(he)物(wu)。加(jia)底(di)物(wu)A和B，底(di)物(wu)在HRP催(cui)化(hua)下，產生藍(lan)色(se)產物(wu)，在終止(zhi)液（2M 硫(liu)酸）作用(yong)下，最終轉(zhuan)化為(wei)黃(huang)色(se)，在酶(mei)標儀(yi)450nm波(bo)長上(shang)測(ce)定吸(xi)光(guang)度(du)（OD值），吸(xi)光(guang)度(du)（OD值）與待測(ce)樣(yang)品(pin)中小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）的濃度(du)負(fu)相關(guan)。擬(ni)合(he)校(xiao)準(zhun)品(pin)曲(qu)線，可(ke)以(yi)計算(suan)出(chu)樣(yang)本中小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG）的濃度(du)。

試劑(ji)盒(he)限制(zhi)性

1、 僅供(gong)科(ke)研(yan)使用(yong)，不得(de)用(yong)於臨(lin)床診(zhen)斷。

2、 在試劑(ji)盒(he)標示(shi)的有(you)效期內(nei)使用(yong)，過(guo)期產(chan)品(pin)不得(de)使用(yong)。

3、 跟其他廠家的試劑(ji)盒(he)或者組分(fen)不能(neng)混用(yong)。

4、 使用(yong)試劑(ji)盒(he)配套的樣(yang)品(pin)稀釋液。

5、 如果樣(yang)本值高(gao)於最高(gao)標準品(pin)濃度(du)值，請(qing)將樣(yang)本適當(dang)稀(xi)釋後，再(zai)重新(xin)測(ce)定。

6、 待測(ce)樣(yang)本中存在的人(ren)抗(kang)鼠(shu)等(deng)異(yi)嗜(shi)抗(kang)體(ti)會幹擾(rao)檢(jian)測(ce)結果，檢(jian)測(ce)前，請(qing)排(pai)出(chu)該(gai)因(yin)素。

7、 通過(guo)其他方(fang)法(fa)得到(dao)的檢(jian)測(ce)結果，與本試劑(ji)盒(he)測(ce)定結(jie)果不(bu)具(ju)有(you)直(zhi)接的可(ke)比性(xing)。

技(ji)術(shu)提示(shi)

1、 混合(he)蛋白溶液時(shi)，避(bi)免(mian)起(qi)泡(pao)。

2、 加(jia)校(xiao)準(zhun)品(pin)與樣(yang)本時(shi)，每個(ge)校(xiao)準(zhun)品(pin)濃度(du)和樣(yang)本都(dou)要更(geng)換(huan)移液槍頭(tou)，公(gong)共(gong)組分(fen)應該(gai)懸臂加(jia)樣(yang)，避(bi)免(mian)交叉(cha)汙(wu)染(ran)。

3、 合(he)適的溫(wen)育時(shi)間，和充(chong)分(fen)的洗(xi)滌步(bu)驟(zhou)，是保(bao)證實(shi)驗(yan)結(jie)果準(zhun)確(que)性(xing)的必(bi)要條件。

4、 使用(yong)自動(dong)洗板(ban)機時(shi)，加(jia)入(ru)壹個(ge)30秒(miao)浸泡(pao)的步(bu)驟(zhou)，可以提高(gao)檢(jian)測(ce)精(jing)度(du)。

5、 底(di)物(wu)溶(rong)液為(wei)無色(se)液(ye)體(ti)，保存過(guo)程(cheng)中變(bian)為(wei)藍色(se)，代(dai)表底(di)物(wu)溶(rong)液已經失(shi)效，不(bu)得(de)使用(yong)。

6、 終止(zhi)液加(jia)樣(yang)順(shun)序(xu)與底(di)物(wu)溶(rong)液加(jia)樣(yang)順(shun)序(xu)壹致(zhi)，加(jia)入(ru)終止(zhi)液後(hou)，藍色底(di)物(wu)產(chan)物(wu)，會瞬間變(bian)為(wei)黃(huang)色(se)。

7、 實驗(yan)中，用(yong)剩的板(ban)條，應立(li)即(ji)放(fang)回自封(feng)袋中，密封（低溫(wen)幹燥(zao)）保存。

8、 所(suo)有液體(ti)組分(fen)，使用(yong)前充(chong)分(fen)搖勻(yun)，嚴格按(an)照(zhao)說明書標明的時(shi)間、加(jia)樣(yang)量及(ji)加(jia)樣(yang)順(shun)序(xu)進(jin)行(xing)溫(wen)育操(cao)作。

試劑(ji)盒(he)組分(fen)與保存

未開(kai)封的試劑(ji)盒(he)保(bao)存在2-8度(du)，不得(de)使用(yong)過(guo)期試劑(ji)盒(he)。

標準品(pin)濃度(du)依次(ci)為(wei)：64、32、16、8、4、0 ng/mL.

其他用(yong)品(pin)

1、 酶(mei)標儀(yi)（450nm）

2、 精(jing)密(mi)移液器及壹次(ci)性(xing)吸(xi)頭(tou)

3、 蒸餾(liu)水(shui)

4、 洗瓶(ping)或者自動(dong)洗板(ban)機

5、 37℃水(shui)浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱

6、 500ml量筒(tong)

生物(wu)安(an)全(quan)

1、 檢(jian)測(ce)必須(xu)符合(he)實驗(yan)室(shi)管(guan)理(li)規範(fan)的規定，嚴格防止(zhi)交叉(cha)汙(wu)染(ran)，所(suo)有樣(yang)品(pin)、洗棄(qi)液(ye)和各種廢(fei)棄(qi)物(wu)都(dou)應按(an)照(zhao)傳染(ran)物(wu)進(jin)行(xing)處(chu)置。

2、 試劑(ji)盒(he)的液體(ti)組分(fen)中，含有proclin-300防腐劑(ji)，可能(neng)引(yin)起(qi)皮(pi)膚過(guo)敏(min)反應，避(bi)免(mian)吸入(ru)煙霧與皮(pi)膚接(jie)觸(chu)。

3、 底(di)物(wu)液(ye)對皮(pi)膚、眼(yan)睛(jing)和上(shang)呼(hu)吸(xi)道有刺激作(zuo)用(yong)，避(bi)免(mian)吸入(ru)煙霧。

4、 戴上(shang)防護手(shou)套，實驗(yan)完(wan)成(cheng)後洗(xi)手(shou)。

樣(yang)品(pin)的采集(ji)和儲(chu)存

以下只是列出(chu)樣(yang)品(pin)采集(ji)和保(bao)存的壹般(ban)指(zhi)南(nan)。所(suo)有樣(yang)本采集(ji)保(bao)存過(guo)程(cheng)中，不得使用(yong)疊氮(dan)鈉做為(wei)防腐劑(ji)。

1、 細胞培(pei)養(yang)上(shang)清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xi)胞顆粒和聚(ju)合(he)物(wu)，上(shang)清液(ye)保存在- 20℃以下，避(bi)免(mian)反復凍融(rong)。

2、 血清：使用(yong)不含(han)熱原(yuan)和內(nei)毒(du)素的試管(guan)，操(cao)作過(guo)程(cheng)中避(bi)免(mian)任何(he)細胞刺(ci)激，4000rpm條件下離心20min，小(xiao)心地分(fen)離出(chu)血清，保(bao)存在-20℃以下，避(bi)免(mian)反復凍融(rong)。

3、 血漿(jiang)：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作(zuo)為(wei)抗凝劑(ji)。在4000rpm條件下，離心(xin)20分(fen)鐘取上(shang)清，血(xue)漿保存在-20℃以下，避(bi)免(mian)反復凍融(rong)。

樣(yang)本收(shou)集(ji)後，無法壹次(ci)檢(jian)測(ce)完(wan)畢(bi)，請(qing)按(an)壹次(ci)用(yong)量分(fen)裝凍(dong)存，避(bi)免(mian)反復凍融(rong)，使用(yong)時(shi)在室(shi)溫(wen)下解凍，確保樣(yang)品(pin)均(jun)勻(yun)充(chong)分(fen)解凍(dong)。

4、 組織(zhi)勻(yun)漿：用(yong)預(yu)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖(chong)洗(xi)組織(zhi)，去(qu)除殘(can)留(liu)血(xue)液(ye)，稱(cheng)重(zhong)後將組織(zhi)剪(jian)碎。將剪(jian)碎(sui)的組織(zhi)與對應體(ti)積的PBS(壹般(ban)按(an)1: 9的重(zhong)量體(ti)積比，比如1g的組織(zhi)樣(yang)品(pin)對應9 mL的PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積可根據(ju)實驗(yan)需(xu)要適當(dang)調(tiao)整，並(bing)做好記(ji)錄(lu)。推薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji))加(jia)入(ru)玻璃(li)勻(yun)漿器(qi)中，在冰(bing)上(shang)充(chong)分(fen)研磨。為(wei)了(le)進(jin)壹步(bu)裂(lie)解(jie)組織(zhi)細(xi)胞，可(ke)以(yi)對勻(yun)漿液(ye)進(jin)行(xing)超(chao)聲(sheng)破(po)碎(sui)或反復凍融(rong)。最後(hou)將勻(yun)漿液(ye)5000×g離心 5-10分(fen)鐘，取上(shang)清檢(jian)測(ce)。

5、 細胞提(ti)取液：貼(tie)壁(bi)細(xi)胞用(yong)冷的PBS輕(qing)輕(qing)清洗(xi)，然後用(yong)胰(yi)蛋白酶(mei)消(xiao)化，1000×g離(li)心(xin)5分(fen)鐘後收(shou)集(ji)細胞；懸浮細(xi) 胞可(ke)直(zhi)接離(li)心收(shou)集(ji)。收(shou)集(ji)的細(xi)胞用(yong)冷的PBS洗(xi)滌3次(ci)。每(mei) 1×106 個(ge)細胞中加(jia)入(ru)150-200μLPBS重懸並通(tong)過(guo)反復凍融(rong)使細胞破(po)碎(sui)(若(ruo)含(han)量很低可(ke)減(jian)少PBS的體(ti)積)。將提(ti)取液於(yu)1500×g離(li)心10分(fen)鐘，取上(shang)清檢(jian)測(ce)。  

6、 其他生物(wu)體(ti)液：1000×g 離(li)心(xin)20分(fen)鐘，除去(qu)雜質及(ji)細(xi)胞碎(sui)片(pian)。取上(shang)清檢(jian)測(ce)。

試劑(ji)準備(bei)

1、 使用(yong)前，所(suo)有的組分(fen)都(dou)要至(zhi)少復溫(wen)60min，確保(bao)充(chong)分(fen)復溫(wen)到(dao)室(shi)溫(wen)。

2、 濃縮洗(xi)滌液(ye)：從(cong)冰(bing)箱取出的濃縮洗(xi)滌液(ye)，會有結晶(jing)產(chan)生，這屬(shu)於正(zheng)常(chang)現(xian)象(xiang)，水(shui)浴加(jia)熱使結晶(jing)溶解(jie)。濃縮洗(xi)滌液(ye)與蒸餾(liu)水(shui)，按(an)1:20稀釋，即1份的濃縮洗(xi)滌液(ye)，添加(jia)19份的蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

3、 底(di)物(wu)：底(di)物(wu)液(ye)A和B，在使用(yong)前，按(an)1:1體(ti)積充(chong)分(fen)混合(he)，混合(he)後15分(fen)鐘內使用(yong)。

操作(zuo)程(cheng)序

所(suo)有試劑(ji)和組分(fen)都(dou)先(xian)恢(hui)復到(dao)室(shi)溫(wen)，標準品(pin)、質控品(pin)和樣(yang)品(pin)，建議(yi)做復孔(kong)。

1、 按(an)前面(mian)說明書描(miao)述(shu)的方(fang)法，配制(zhi)好試劑(ji)盒(he)各種組分(fen)的工(gong)作液(ye)。

2、 從(cong)鋁(lv)箔袋中取出所(suo)需板(ban)條，剩余的板(ban)條用(yong)自封(feng)袋密(mi)封放回(hui)冰(bing)箱。

設置標準品(pin)孔(kong)、空(kong)白孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)，標準品(pin)孔(kong)各加(jia)不(bu)同(tong)濃度(du)的標準品(pin)50μL，空(kong)白孔(kong)不(bu)加(jia)，樣(yang)本孔(kong)加(jia)待(dai)測(ce)樣(yang)本50μL。

3、除空(kong)白孔(kong)外(wai)，標準品(pin)孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)，加(jia)入(ru)辣根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)（HRP）標記(ji)的檢(jian)測(ce)抗原(yuan)100μL。

4、 用(yong)封板(ban)膜蓋(gai)住(zhu)反應板(ban)，37℃水(shui)浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5、 揭開(kai)封板(ban)膜，棄去液體(ti)，吸水(shui)紙上(shang)拍幹，每(mei)孔(kong)加(jia)滿洗滌液(ye)，靜(jing)置20S，甩去洗(xi)滌液(ye)，吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍幹，如此重(zhong)復5次(ci)。若(ruo)使用(yong)自動(dong)洗板(ban)機，請(qing)按(an)洗(xi)板(ban)機操(cao)作(zuo)程(cheng)序進(jin)行(xing)洗(xi)板(ban)，添加(jia)浸(jin)泡(pao)30s的程(cheng)序，可(ke)以(yi)提高(gao)檢(jian)測(ce)的精(jing)度(du)。洗板(ban)結束，加(jia)底(di)物(wu)前，要在幹凈(jing)不掉屑的紙上(shang)，充(chong)分(fen)拍幹反應板(ban)。

6、 將底(di)物(wu)A和B按(an)1:1體(ti)積充(chong)分(fen)混合(he)，所(suo)有孔(kong)中加(jia)入(ru)底(di)物(wu)混合(he)液100μL。用(yong)封板(ban)膜蓋(gai)住(zhu)反應板(ban)，37℃水(shui)浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育15min。

7、 所(suo)有孔(kong)加(jia)入(ru)終止(zhi)液50μL，在酶(mei)標儀(yi)上(shang)讀(du)取各孔(kong)吸(xi)光(guang)度(du)（OD值）。

結果計(ji)算(suan)

1、 以標準品(pin)濃度(du)做為(wei)橫(heng)坐標，對應的吸(xi)光(guang)度(du)（OD值）作(zuo)為(wei)縱坐標，利(li)用(yong)計算(suan)機(ji)軟件，采用(yong)四參(can)數(shu)Logistic曲(qu)線擬(ni)合(he)（4-pl），創建(jian)標準曲(qu)線方(fang)程(cheng)，通過(guo)樣(yang)本的吸(xi)光(guang)度(du)（OD值），利(li)用(yong)方程(cheng)計算(suan)樣(yang)品(pin)的濃度(du)值。

2、 如果樣(yang)品(pin)被稀釋，通過(guo)上(shang)述(shu)方法(fa)測(ce)的濃度(du)值，要乘以稀釋倍數(shu)，才(cai)是(shi)樣(yang)品(pin)的最終濃度(du)。

試劑(ji)盒(he)性(xing)能(neng)指(zhi)標

1、物(wu)理(li)性能(neng)

試劑(ji)盒(he)的各液(ye)體(ti)組分(fen)應澄(cheng)清透明、無沈(chen)澱或者絮狀物(wu)。微(wei)孔(kong)板(ban)鋁(lv)箔袋應真(zhen)空(kong)包(bao)裝，無(wu)破損(sun)漏氣(qi)。

2、劑(ji)量反應曲(qu)線線性(xing)

校(xiao)準(zhun)品(pin)劑(ji)量反應曲(qu)線相關(guan)系(xi)數r值，大於等(deng)於(yu)0.9900。

3、精(jing)密(mi)度(du)

批內(nei)精(jing)密(mi)度(du)：三組已知的高(gao)、中、低濃度(du)樣(yang)品(pin)，進(jin)行(xing)二(er)十(shi)次(ci)在同(tong)壹個(ge)板(ban)塊內(nei)精(jing)度(du)評估。批內(nei)變(bian)異系(xi)數CV%小(xiao)於10%。

批間精(jing)密(mi)度(du)：三組已知的高(gao)、中、低濃度(du)樣(yang)品(pin)，進(jin)行(xing)二(er)十(shi)次(ci)在不同(tong)板(ban)塊內(nei)精(jing)度(du)評估。批間變(bian)異系(xi)數CV%小(xiao)於15%。

4、靈(ling)敏(min)度(du)

檢(jian)出劑(ji)量小(xiao)於0.1 ng/mL。

5、回收(shou)率(lv)

三組已知的高(gao)、中、低濃度(du)樣(yang)品(pin)，進(jin)行(xing)五次(ci)在同(tong)壹個(ge)板(ban)塊內(nei)回收(shou)率(lv)評估，回收(shou)率(lv)在85%-115%之間。

6、特異(yi)性(xing)

本試劑(ji)盒(he)識別(bie)天然(ran)和重(zhong)組小(xiao)鼠8-氧鳥(niao)嘌(piao)呤(ling)脫氧核苷（8-oxo-dG），與結構(gou)類似(si)物(wu)無(wu)交叉(cha)。

7、穩定性(xing)

2℃-8℃保存，有(you)效期6個(ge)月(yue)。

8、 檢(jian)測(ce)範(fan)圍(wei)

2 ng/mL - 64 ng/mL