βGAL ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)人β半乳糖(tang)苷酶定(ding)量檢(jian)測(ce)方法

l 本試(shi)劑(ji)盒(he)用(yong)於體外定(ding)量檢(jian)測(ce)血清、血漿(jiang)、組(zu)織勻漿(jiang)及相關液(ye)體樣本中(zhong)人β半乳糖(tang)苷酶（βGAL）的含(han)量。

l 有(you)效(xiao)期：6個月(yue)

l 保存條件(jian)：2-8℃

l 本試(shi)劑(ji)盒(he)僅(jin)供科(ke)研使用(yong)，不(bu)得用(yong)於臨床(chuang)診斷(duan)

實(shi)驗原理(li)

試(shi)劑(ji)盒(he)采(cai)用(yong)雙(shuang)抗(kang)體壹步(bu)夾心(xin)法酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸附試(shi)驗（ELISA）。往預(yu)先包被人β半乳糖(tang)苷酶（βGAL）捕獲(huo)抗(kang)體的包(bao)被微(wei)孔中(zhong)，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記(ji)的檢測抗(kang)體，經過(guo)溫育(yu)並洗滌(di)。用(yong)底物(wu)TMB顯(xian)色(se)，TMB在過(guo)氧化(hua)物(wu)酶的(de)催(cui)化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)藍色(se)，並在酸(suan)的作(zuo)用(yong)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)最終(zhong)的黃(huang)色(se)。顏色(se)的深(shen)淺(qian)和樣品(pin)中(zhong)的(de)人β半乳糖(tang)苷酶（βGAL）呈正相關。用(yong)酶標(biao)儀在450nm 波長下(xia)測(ce)定(ding)吸光度（OD 值），計算(suan)樣品(pin)濃(nong)度(du)。

樣本處(chu)理及要(yao)求(qiu)

1.  血清：將收集(ji)於(yu)血清分(fen)離管(guan)的全血(xue)標(biao)本在室(shi)溫放置(zhi)2小(xiao)時(shi)或4℃過(guo)夜(ye)，然後1000×g離(li)心(xin)20 分(fen)鐘，取(qu)上清即(ji)可(ke)，或將上(shang)清置於-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免(mian)反復凍融。
2.  血(xue)漿(jiang)：用(yong)EDTA或肝(gan)素(su)作(zuo)為抗(kang)凝(ning)劑采(cai)集標(biao)本，並將標(biao)本在采(cai)集後的(de)30分(fen)鐘內(nei)於2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分(fen)鐘，取(qu)上清即(ji)可(ke)檢測(ce)，或將上(shang)清置於-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免(mian)反復凍融。
3.  組(zu)織勻漿(jiang)：用(yong)預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織，去(qu)除殘(can)留(liu)血(xue)液(ye)（勻漿(jiang)中(zhong)裂(lie)解(jie)的(de)紅(hong)細胞(bao)會(hui)影(ying)響測(ce)量結(jie)果(guo)），稱重後將組(zu)織剪(jian)碎(sui)。將剪(jian)碎(sui)的(de)組(zu)織與(yu)對(dui)應體積的(de)PBS（壹(yi)般(ban)按(an)1:9的(de)重量體積比(bi)，比(bi)如1g的(de)組(zu)織樣品(pin)對(dui)應9mL的PBS，具體體積可(ke)根(gen)據(ju)實驗需要(yao)適當調整(zheng)，並做(zuo)好(hao)記(ji)錄。推(tui)薦在PBS中(zhong)加(jia)入(ru)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑）加(jia)入玻(bo)璃(li)勻漿(jiang)器中(zhong)，於(yu)冰(bing)上(shang)充分(fen)研磨(mo)。為了(le)進(jin)壹(yi)步裂(lie)解(jie)組(zu)織細胞(bao)，可(ke)以(yi)對(dui)勻漿(jiang)液進(jin)行超(chao)聲(sheng)破碎(sui)，或反(fan)復凍融。最後將勻漿(jiang)液於(yu)5000×g離心(xin)5~10分(fen)鐘，取(qu)上清檢測。

4.  細胞(bao)培養物(wu)上清或其(qi)它(ta)生物(wu)標(biao)本：請(qing)1000×g離心(xin)20分(fen)鐘，取(qu)上清即(ji)可(ke)檢測(ce)，或將上(shang)清置於-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免(mian)反復凍融。

註(zhu)：標(biao)本溶血會(hui)影(ying)響最後檢(jian)測(ce)結果(guo)，因(yin)此溶血標(biao)本不(bu)宜(yi)進行此(ci)項檢測。

需(xu)要而(er)未提供的試(shi)劑(ji)和器材

1. 酶標(biao)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱

4. 蒸(zheng)餾水(shui)或去(qu)離子(zi)水

試(shi)劑(ji)盒(he)組(zu)成

備(bei)註(zhu)：

1.  標(biao)準品(pin)濃(nong)度(du)依(yi)次(ci)為：400、200、100、50、25、12.5 pg/ml

2.  經過(guo)大(da)量正(zheng)常(chang)標(biao)本檢驗，標(biao)本的正(zheng)常(chang)濃(nong)度值(zhi)均在(zai)試(shi)劑(ji)盒(he)提供的檢測(ce)範圍(wei)內(nei)，實驗過(guo)程(cheng)中(zhong)直(zhi)接(jie)取50μL樣本上樣即(ji)可(ke)。當有部分(fen)樣本值超(chao)過(guo)最大標(biao)準品(pin)濃(nong)度(du)時(shi)，可(ke)用(yong)樣本稀釋液將標(biao)本進行適當稀釋後再(zai)進(jin)行實(shi)驗。

註(zhu)意事(shi)項

1. 嚴格按(an)照(zhao)規定(ding)的(de)時(shi)間和溫度進(jin)行溫育(yu)以(yi)保證(zheng)準確(que)結果(guo)。所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都(dou)必(bi)須在使(shi)用(yong)前達到室(shi)溫20-25℃。使用(yong)後立即(ji)冷藏保存試(shi)劑(ji)。

2. 洗板(ban)不(bu)正(zheng)確(que)可(ke)以(yi)導(dao)致不(bu)準確(que)的結(jie)果(guo)。在加入(ru)底物(wu)前確(que)保盡(jin)量吸幹孔內液體。溫育(yu)過(guo)程(cheng)中(zhong)不(bu)要(yao)讓微(wei)孔幹燥(zao)掉(diao)。

3. 消除板(ban)底(di)殘(can)留(liu)的(de)液(ye)體和手指印(yin)，否(fou)則(ze)影響OD值(zhi)。

4. 底(di)物(wu)顯(xian)色(se)液應呈無色(se)或很(hen)淺的(de)顏色(se)，已經變(bian)藍的底(di)物(wu)液不(bu)能使用(yong)。

5. 避免(mian)試(shi)劑(ji)和標(biao)本的交叉(cha)汙染以(yi)免(mian)造成錯誤結果(guo)。

6. 在儲存和溫育(yu)時(shi)避免(mian)強光直接(jie)照(zhao)射。

7. 平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫後再(zai)打開(kai)密(mi)封(feng)袋(dai)以(yi)防(fang)水滴凝(ning)聚在(zai)冷板(ban)條(tiao)上(shang)。

8. 任何反(fan)應試(shi)劑(ji)不(bu)能接(jie)觸(chu)漂白(bai)溶劑或漂白(bai)溶劑所(suo)散(san)發(fa)的(de)強(qiang)烈氣體。任何漂白(bai)成(cheng)分(fen)都(dou)會(hui)破(po)壞(huai)試(shi)劑(ji)盒(he)中(zhong)反(fan)應試(shi)劑(ji)的(de)生(sheng)物(wu)活性。

9. 不(bu)能使用(yong)過(guo)期(qi)產品(pin)。

10. 如(ru)果(guo)可(ke)能傳播(bo)疾病，所(suo)有(you)的樣品(pin)都(dou)應管(guan)理好(hao)，按(an)照(zhao)規定(ding)的(de)程(cheng)序(xu)處(chu)理樣品(pin)和檢測裝置(zhi)。

試(shi)劑(ji)準備(bei)

試(shi)劑(ji)盒(he)從(cong)冷藏環(huan)境(jing)中(zhong)取(qu)出(chu)應在室(shi)溫平(ping)衡(heng)後方可(ke)使用(yong)。

20×洗滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)的(de)稀釋：蒸(zheng)餾水(shui)按(an)1：20稀釋，即(ji)1份(fen)20×洗滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)加(jia)19份(fen)蒸(zheng)餾水(shui)。

操作(zuo)步驟(zhou)

1.  從(cong)室(shi)溫平(ping)衡(heng)20min後的(de)鋁箔(bo)袋(dai)中(zhong)取(qu)出(chu)所(suo)需(xu)板(ban)條(tiao)，剩(sheng)余(yu)板(ban)條(tiao)用(yong)自(zi)封(feng)袋(dai)密封(feng)放回(hui)4℃。

2.  設置(zhi)標(biao)準品(pin)孔和樣本孔，標(biao)準品(pin)孔各加不(bu)同濃(nong)度(du)的標(biao)準品(pin)50μL；

3.  樣本孔中(zhong)加(jia)入(ru)待(dai)測樣本50μL；空白(bai)孔不(bu)加(jia)。

4.  除空白(bai)孔外，標(biao)準品(pin)孔和樣本孔中(zhong)每(mei)孔加入辣(la)根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標(biao)記(ji)的檢測抗(kang)體100μL，用(yong)封(feng)板(ban)膜(mo)封(feng)住(zhu)反應孔，37℃水浴(yu)鍋(guo)或恒(heng)溫箱溫育(yu)60min。

5.  棄去(qu)液體，吸水紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹，每(mei)孔加滿洗滌(di)液(ye)（350μL），靜(jing)置(zhi)1min，甩(shuai)去(qu)洗滌(di)液(ye)，吸水紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹，如(ru)此重復洗板(ban)5次(ci)（也(ye)可(ke)用(yong)洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。

6.  每(mei)孔加入底物(wu)A、B各50μL，37℃避(bi)光孵育(yu)15min。

7.  每孔加入終(zhong)止液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處(chu)測定(ding)各(ge)孔的OD值。

實驗結果(guo)計算(suan)

以(yi)所(suo)測(ce)標(biao)準品(pin)的(de)OD值(zhi)為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，標(biao)準品(pin)的(de)濃(nong)度(du)值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上(shang)或用(yong)相關軟件(jian)繪制標(biao)準曲線(xian)，並得到直線回歸方程，將樣品(pin)的(de)OD值(zhi)代(dai)入方程，計算(suan)出(chu)樣品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。

試(shi)劑(ji)盒(he)性能

1.  檢測(ce)範圍(wei)：12.5 pg/ml – 400 pg/ml。

2.  靈(ling)敏(min)度(du)：檢測濃度(du)小(xiao)於(yu)1.0 pg/ml。

3.  特異性：不(bu)與(yu)其(qi)它(ta)可(ke)溶性結(jie)構(gou)類(lei)似物(wu)交叉(cha)反(fan)應。

 重復性：板(ban)內(nei)變(bian)異(yi)系數小於10% ，板(ban)間(jian)變(bian)異(yi)系數小於15%