人β半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)（βGAL） 酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附(fu)測(ce)定(ding)試(shi)劑盒說(shuo)明書(shu)

本(ben)試(shi)劑盒用於體外檢(jian)測(ce)血清(qing)、血漿(jiang)、組織(zhi)勻漿(jiang)及(ji)相關(guan)液體樣本(ben)中人β半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)（βGAL）的(de)含(han)量。

實(shi)驗(yan)原(yuan)理：

試(shi)劑盒采(cai)用雙抗(kang)體壹步(bu)夾(jia)心法(fa)酶聯免(mian)疫吸(xi)附(fu)試(shi)驗(yan)（ELISA）。往(wang)預先(xian)包被人β半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)（βGAL）捕(bu)獲抗(kang)體的包被微孔中，依(yi)次加(jia)入標(biao)本(ben)、標(biao)準(zhun)品(pin)、HRP標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體，經(jing)過溫育(yu)並(bing)洗滌(di)。用底物TMB顯色，TMB在過氧(yang)化(hua)物酶(mei)的(de)催化下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍(lan)色，並在酸(suan)的(de)作用下轉化(hua)成(cheng)最(zui)終(zhong)的(de)黃色。顏(yan)色的深淺和(he)樣品(pin)中的人(ren)β半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶(mei)（βGAL）呈(cheng)正(zheng)相關(guan)。用酶標(biao)儀(yi)在450nm 波(bo)長下(xia)測(ce)定(ding)吸(xi)光(guang)度（OD 值(zhi)），計算樣品(pin)濃(nong)度。

樣本(ben)處(chu)理(li)及要(yao)求(qiu)：

1.  血(xue)清：將收集(ji)於血(xue)清(qing)分離(li)管(guan)的(de)全(quan)血(xue)標(biao)本(ben)在室(shi)溫放(fang)置(zhi)2小時(shi)或4℃過夜(ye)，然後(hou)1000×g離(li)心(xin)20 分鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可(ke)，或將上(shang)清置(zhi)於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免(mian)反(fan)復凍融(rong)。

2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝素(su)作為抗(kang)凝劑(ji)采(cai)集(ji)標(biao)本(ben)，並將標(biao)本(ben)在采(cai)集(ji)後(hou)的30分鐘(zhong)內於2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)，或將上(shang)清置(zhi)於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免(mian)反(fan)復凍融(rong)。

3.  組織(zhi)勻漿(jiang)：用預冷(leng)的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組織(zhi)，去除殘(can)留(liu)血(xue)液（勻漿(jiang)中裂解(jie)的紅細(xi)胞(bao)會影(ying)響(xiang)測(ce)量結(jie)果），稱重(zhong)後(hou)將組織(zhi)剪(jian)碎(sui)。將剪(jian)碎(sui)的(de)組織(zhi)與(yu)對(dui)應體積的(de)PBS（壹般(ban)按(an)1:9的(de)重(zhong)量(liang)體積比(bi)，比(bi)如(ru)1g的組織(zhi)樣品(pin)對(dui)應9mL的PBS，具(ju)體體積可(ke)根據(ju)實(shi)驗(yan)需(xu)要(yao)適當調整(zheng)，並做(zuo)好記錄(lu)。推薦(jian)在PBS中加入蛋(dan)白酶(mei)抑制(zhi)劑）加(jia)入玻璃勻漿(jiang)器(qi)中，於冰(bing)上(shang)充(chong)分研磨。為了進壹步(bu)裂解(jie)組織(zhi)細(xi)胞(bao)，可(ke)以(yi)對(dui)勻漿(jiang)液進行超聲(sheng)破碎(sui)，或(huo)反(fan)復凍融(rong)。最後(hou)將勻漿(jiang)液於5000×g離(li)心(xin)5~10分鐘(zhong)，取上(shang)清檢(jian)測(ce)。

4.  細(xi)胞(bao)培(pei)養物上清或(huo)其它生物(wu)標(biao)本(ben)：請(qing)1000×g離(li)心(xin)20分鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)，或將上(shang)清置(zhi)於-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免(mian)反(fan)復凍融(rong)。

註(zhu)：標(biao)本(ben)溶血(xue)會(hui)影(ying)響(xiang)最(zui)後(hou)檢(jian)測(ce)結果(guo)，因此(ci)溶(rong)血(xue)標(biao)本(ben)不宜進行此(ci)項(xiang)檢(jian)測(ce)。

需要(yao)而未提(ti)供(gong)的試(shi)劑和(he)器(qi)材：

1. 酶(mei)標(biao)儀(yi)（450nm）

2. 高(gao)精度加樣(yang)器(qi)及槍(qiang)頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱(xiang)

4. 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或(huo)去離(li)子水

試(shi)劑盒組成(cheng)：

備(bei)註(zhu)：

1.  標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度依(yi)次為：400、200、100、50、25、12.5 pg/ml

2.  經(jing)過大(da)量(liang)正(zheng)常(chang)標(biao)本(ben)檢(jian)驗(yan)，標(biao)本(ben)的正(zheng)常(chang)濃度值(zhi)均(jun)在(zai)試(shi)劑盒提(ti)供(gong)的檢(jian)測(ce)範圍內，實驗(yan)過程中直(zhi)接(jie)取50μL樣(yang)本(ben)上樣(yang)即(ji)可(ke)。當有部(bu)分樣本(ben)值(zhi)超過最(zui)大(da)標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度時(shi)，可(ke)用樣本(ben)稀(xi)釋(shi)液將標(biao)本(ben)進行適(shi)當稀(xi)釋(shi)後(hou)再(zai)進行實(shi)驗(yan)。

註(zhu)意事(shi)項(xiang)：

1. 嚴(yan)格(ge)按(an)照(zhao)規定(ding)的時(shi)間和(he)溫度進行溫育(yu)以(yi)保(bao)證準(zhun)確(que)結果(guo)。所有試(shi)劑都必(bi)須在使用前(qian)達到(dao)室(shi)溫20-25℃。使用後(hou)立即冷(leng)藏(zang)保(bao)存(cun)試(shi)劑。

2. 洗板不正確(que)可(ke)以(yi)導(dao)致不準(zhun)確(que)的結(jie)果。在(zai)加(jia)入底物前(qian)確(que)保(bao)盡量吸(xi)幹孔(kong)內液體。溫育(yu)過程中不要(yao)讓微孔幹(gan)燥掉。

3. 消(xiao)除板底(di)殘(can)留(liu)的(de)液體和(he)手指印(yin)，否則(ze)影響(xiang)OD值(zhi)。

4. 底(di)物(wu)顯(xian)色液應呈(cheng)無(wu)色或很淺的顏(yan)色，已(yi)經(jing)變藍(lan)的底(di)物(wu)液不能使用。

5. 避免(mian)試(shi)劑和(he)標(biao)本(ben)的交(jiao)叉(cha)汙染以(yi)免(mian)造(zao)成(cheng)錯(cuo)誤(wu)結(jie)果。

6. 在儲(chu)存(cun)和(he)溫育(yu)時(shi)避免(mian)強光(guang)直(zhi)接(jie)照射。

7. 平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫後(hou)再(zai)打開(kai)密封(feng)袋以(yi)防(fang)水(shui)滴凝聚(ju)在(zai)冷(leng)板條上。

8. 任(ren)何反(fan)應試(shi)劑不能接(jie)觸漂(piao)白(bai)溶(rong)劑(ji)或(huo)漂(piao)白(bai)溶(rong)劑(ji)所(suo)散(san)發的強(qiang)烈(lie)氣(qi)體。任(ren)何漂(piao)白(bai)成(cheng)分都會破壞試(shi)劑盒中反(fan)應試(shi)劑的(de)生物(wu)活性(xing)。

9. 不能使用過期(qi)產(chan)品(pin)。

10. 如(ru)果可(ke)能傳(chuan)播(bo)疾(ji)病，所(suo)有的(de)樣(yang)品(pin)都應管理(li)好，按(an)照(zhao)規定(ding)的程序(xu)處(chu)理(li)樣品(pin)和(he)檢(jian)測(ce)裝置(zhi)。

試(shi)劑準(zhun)備(bei)：

試(shi)劑盒從冷(leng)藏(zang)環境(jing)中取出(chu)應在室(shi)溫平(ping)衡(heng)後(hou)方可(ke)使用。

20×洗滌(di)緩沖(chong)液的稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按(an)1：20稀(xi)釋(shi)，即(ji)1份(fen)20×洗滌(di)緩沖(chong)液加19份(fen)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

操作步(bu)驟：

1.  從室(shi)溫平(ping)衡(heng)20min後(hou)的鋁箔(bo)袋(dai)中取出(chu)所需(xu)板條，剩余板條用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放(fang)回4℃。

2.  設(she)置(zhi)標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和(he)樣本(ben)孔，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)各加不同(tong)濃度的標(biao)準(zhun)品(pin)50μL；

3.  樣(yang)本(ben)孔中加入待測(ce)樣本(ben)50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和(he)樣本(ben)孔中每孔(kong)加(jia)入辣(la)根過氧(yang)化(hua)物酶(mei)（HRP）標(biao)記(ji)的(de)檢(jian)測(ce)抗(kang)體100μL，用封板膜封(feng)住反(fan)應孔，37℃水(shui)浴鍋(guo)或恒(heng)溫箱(xiang)溫育(yu)60min。

5.  棄去液體，吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)幹，每(mei)孔加滿(man)洗滌(di)液（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗滌(di)液，吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)幹，如(ru)此(ci)重(zhong)復(fu)洗板5次(ci)（也可(ke)用洗板機(ji)洗板）。

6.  每(mei)孔加(jia)入底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵育(yu)15min。

7.  每(mei)孔(kong)加(jia)入終(zhong)止(zhi)液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處(chu)測(ce)定(ding)各孔的OD值(zhi)。

實(shi)驗(yan)結(jie)果：

以(yi)所(suo)測(ce)標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)OD值(zhi)為橫坐(zuo)標(biao)，標(biao)準(zhun)品(pin)的(de)濃度值(zhi)為縱坐標(biao)，在(zai)坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上或(huo)用相關(guan)軟件繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線，並(bing)得到(dao)直(zhi)線(xian)回歸(gui)方程，將樣(yang)品(pin)的(de)OD值(zhi)代(dai)入方程，計算出(chu)樣品(pin)的(de)濃度。

（此(ci)圖(tu)僅(jin)供(gong)參考(kao)）

試(shi)劑盒性(xing)能：

1.  檢(jian)測(ce)範圍：12.5 pg/ml – 400 pg/ml。

2.  靈(ling)敏度：檢(jian)測(ce)濃度小於(yu)1.0 pg/ml。

3.  特異性(xing)：不與(yu)其它可(ke)溶性(xing)結構類(lei)似物(wu)交(jiao)叉(cha)反(fan)應。

 重復(fu)性(xing)：板內變異(yi)系數(shu)小於(yu)10% ，板間(jian)變異(yi)系數(shu)小於(yu)15%