Mouse MCP1 ELISA Kit科(ke)研(yan)試(shi)劑(ji)盒原理

小鼠(shu)單核(he)細(xi)胞趨(qu)化蛋(dan)白(bai)1（MCP-1）試(shi)劑(ji)盒（ELISA）

使用說(shuo)明(ming)書(shu)

l 本試(shi)劑(ji)盒用於(yu)體(ti)外定(ding)量(liang)檢測(ce)血清、血漿(jiang)、組織勻(yun)漿(jiang)及(ji)相(xiang)關液(ye)體(ti)樣本(ben)中(zhong)小鼠(shu)單核(he)細(xi)胞趨(qu)化蛋(dan)白(bai)1（MCP-1）的含(han)量(liang)。

l 有(you)效期：6個月

l 保(bao)存(cun)條(tiao)件(jian)：2-8℃

l 本試(shi)劑(ji)盒僅(jin)供科(ke)研(yan)使用，不(bu)得(de)用(yong)於(yu)臨床(chuang)診斷

實(shi)驗原(yuan)理

試(shi)劑(ji)盒采用(yong)雙(shuang)抗(kang)體(ti)壹步夾心(xin)法(fa)酶(mei)聯免疫吸附試(shi)驗(yan)（ELISA）。往預(yu)先包(bao)被(bei)小鼠(shu)單核(he)細(xi)胞趨(qu)化蛋(dan)白(bai)1（MCP-1）捕獲(huo)抗(kang)體(ti)的包(bao)被(bei)微孔(kong)中(zhong)，依次加(jia)入(ru)標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的檢測(ce)抗體(ti)，經(jing)過(guo)溫(wen)育(yu)並(bing)洗(xi)滌。用(yong)底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在(zai)過(guo)氧(yang)化物酶(mei)的(de)催(cui)化下(xia)轉化成(cheng)藍色(se)，並(bing)在(zai)酸(suan)的(de)作用(yong)下(xia)轉化成(cheng)最(zui)終的黃色。顏色的(de)深淺和樣品(pin)中(zhong)的(de)小鼠(shu)單核(he)細(xi)胞趨(qu)化蛋(dan)白(bai)1（MCP-1）呈(cheng)正相(xiang)關。用(yong)酶(mei)標(biao)儀在450nm 波長下(xia)測定吸光度(du)（OD 值），計算樣品(pin)濃度。

樣本(ben)處理及(ji)要(yao)求

1.  血清：將收(shou)集(ji)於(yu)血清分(fen)離(li)管的全(quan)血(xue)標(biao)本在室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi)2小時或(huo)4℃過(guo)夜，然(ran)後(hou)1000×g離心(xin)20 分(fen)鐘，取上清即(ji)可，或(huo)將上(shang)清置於(yu)-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但(dan)應避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝(gan)素(su)作為(wei)抗凝(ning)劑(ji)采集(ji)標(biao)本，並將(jiang)標(biao)本在采集(ji)後(hou)的(de)30分(fen)鐘內(nei)於(yu)2-8℃ 1000×g離心(xin)15分(fen)鐘，取上清即(ji)可檢測(ce)，或將(jiang)上清置於(yu)-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但(dan)應避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融。
3.  組織勻(yun)漿(jiang)：用預(yu)冷(leng)的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織，去(qu)除(chu)殘留血(xue)液（勻(yun)漿(jiang)中(zhong)裂(lie)解的紅(hong)細(xi)胞會(hui)影響測量(liang)結果），稱(cheng)重後(hou)將組織剪碎。將剪碎的組織與對(dui)應(ying)體(ti)積的PBS（壹般(ban)按(an)1:9的重(zhong)量(liang)體(ti)積比，比如(ru)1g的組織樣品(pin)對應(ying)9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積可根據(ju)實(shi)驗需要(yao)適當調整(zheng)，並做好(hao)記錄(lu)。推(tui)薦(jian)在(zai)PBS中(zhong)加(jia)入(ru)蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)）加(jia)入(ru)玻(bo)璃勻(yun)漿(jiang)器中(zhong)，於(yu)冰上(shang)充(chong)分(fen)研(yan)磨(mo)。為(wei)了(le)進(jin)壹步裂(lie)解組織細胞，可以(yi)對(dui)勻(yun)漿(jiang)液進(jin)行(xing)超(chao)聲破碎，或反(fan)復(fu)凍(dong)融。最(zui)後將(jiang)勻(yun)漿(jiang)液於(yu)5000×g離心(xin)5~10分(fen)鐘，取上清檢測(ce)。

4.  細胞培養物上清或其(qi)它(ta)生物標(biao)本：請(qing)1000×g離心(xin)20分(fen)鐘，取上清即(ji)可檢測(ce)，或將(jiang)上清置於(yu)-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但(dan)應避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融。

註：標(biao)本溶血會(hui)影響最後檢測(ce)結果，因此溶血標(biao)本不宜進行(xing)此(ci)項檢測(ce)。

需要(yao)而(er)未(wei)提供的試(shi)劑(ji)和器材(cai)

1. 酶(mei)標(biao)儀（450nm）

2. 高精(jing)度(du)加(jia)樣(yang)器(qi)及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫(wen)箱(xiang)

4. 蒸餾水或(huo)去(qu)離(li)子水

試(shi)劑(ji)盒組成

備(bei)註：

1.  標(biao)準品(pin)濃度依次為：1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/ml

2.  經(jing)過(guo)大(da)量(liang)正常(chang)標(biao)本檢驗(yan)，標(biao)本的正(zheng)常(chang)濃度值均在(zai)試(shi)劑(ji)盒提供的檢測(ce)範圍內(nei)，實(shi)驗過(guo)程中(zhong)直(zhi)接取50μL樣本(ben)上樣(yang)即(ji)可。當(dang)有(you)部(bu)分(fen)樣(yang)本值超(chao)過(guo)最(zui)大(da)標(biao)準品(pin)濃度時(shi)，可用(yong)樣本稀釋(shi)液將標(biao)本進行(xing)適當稀釋(shi)後再進行(xing)實(shi)驗。

註意(yi)事項

1. 嚴格按(an)照規定的時間和溫(wen)度(du)進(jin)行(xing)溫(wen)育(yu)以(yi)保(bao)證(zheng)準確(que)結果。所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都(dou)必(bi)須在(zai)使用前(qian)達到(dao)室(shi)溫(wen)20-25℃。使用後(hou)立(li)即(ji)冷(leng)藏(zang)保(bao)存(cun)試(shi)劑(ji)。

2. 洗板(ban)不(bu)正(zheng)確(que)可(ke)以導(dao)致不(bu)準確(que)的(de)結果。在(zai)加(jia)入(ru)底(di)物前確(que)保(bao)盡(jin)量(liang)吸幹(gan)孔內(nei)液(ye)體(ti)。溫(wen)育(yu)過(guo)程中(zhong)不(bu)要(yao)讓微孔(kong)幹(gan)燥掉。

3. 消除(chu)板(ban)底(di)殘(can)留的(de)液體(ti)和手(shou)指(zhi)印(yin)，否(fou)則(ze)影響OD值。

4. 底物顯(xian)色(se)液(ye)應(ying)呈(cheng)無(wu)色(se)或(huo)很(hen)淺的顏色，已(yi)經(jing)變(bian)藍的(de)底(di)物液不(bu)能(neng)使用。

5. 避免(mian)試(shi)劑(ji)和標(biao)本的交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)以(yi)免造成(cheng)錯誤(wu)結果。

6. 在儲(chu)存(cun)和溫(wen)育(yu)時(shi)避(bi)免強(qiang)光直(zhi)接(jie)照射。

7. 平(ping)衡(heng)至室(shi)溫(wen)後(hou)再打(da)開密封(feng)袋以(yi)防(fang)水滴(di)凝(ning)聚(ju)在(zai)冷(leng)板(ban)條(tiao)上(shang)。

8. 任(ren)何反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)不(bu)能(neng)接(jie)觸漂白(bai)溶劑或漂白(bai)溶劑所散發(fa)的(de)強(qiang)烈氣體(ti)。任(ren)何漂白(bai)成分(fen)都(dou)會(hui)破壞試(shi)劑(ji)盒中(zhong)反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物活性(xing)。

9. 不能(neng)使用過(guo)期產(chan)品(pin)。

10. 如(ru)果可(ke)能(neng)傳(chuan)播(bo)疾病(bing)，所有(you)的樣(yang)品(pin)都(dou)應(ying)管理好，按(an)照規定的程序(xu)處(chu)理樣品(pin)和檢測(ce)裝置(zhi)。

試(shi)劑(ji)準備(bei)

試(shi)劑(ji)盒從(cong)冷(leng)藏(zang)環(huan)境(jing)中(zhong)取出(chu)應(ying)在(zai)室溫(wen)平(ping)衡(heng)後方可使用。

20×洗滌(di)緩沖液的(de)稀釋(shi)：蒸餾水按(an)1：20稀釋(shi)，即(ji)1份(fen)20×洗滌(di)緩沖液加(jia)19份(fen)蒸餾水。

操作(zuo)步驟

1.  從(cong)室(shi)溫(wen)平(ping)衡(heng)20min後的(de)鋁(lv)箔(bo)袋(dai)中(zhong)取出(chu)所(suo)需板(ban)條(tiao)，剩(sheng)余板(ban)條(tiao)用(yong)自封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2.  設(she)置(zhi)標(biao)準品(pin)孔和樣本(ben)孔，標(biao)準品(pin)孔各(ge)加(jia)不(bu)同(tong)濃度的(de)標(biao)準品(pin)50μL；

3.  樣本(ben)孔中(zhong)加(jia)入(ru)待測樣本50μL；空(kong)白(bai)孔(kong)不(bu)加(jia)。

4.  除(chu)空(kong)白(bai)孔(kong)外(wai)，標(biao)準品(pin)孔和樣本(ben)孔中(zhong)每(mei)孔加(jia)入(ru)辣(la)根過(guo)氧(yang)化物酶(mei)（HRP）標(biao)記的檢測(ce)抗體(ti)100μL，用封(feng)板(ban)膜封(feng)住反(fan)應(ying)孔，37℃水浴(yu)鍋或(huo)恒溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育(yu)60min。

5.  棄去(qu)液(ye)體(ti)，吸水紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗滌(di)液(ye)（350μL），靜置(zhi)1min，甩去(qu)洗(xi)滌(di)液，吸水紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，如(ru)此重(zhong)復洗(xi)板(ban)5次（也可用(yong)洗(xi)板(ban)機洗板(ban)）。

6.  每(mei)孔加(jia)入(ru)底(di)物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵(fu)育(yu)15min。

7.  每(mei)孔加(jia)入(ru)終止液50μL，15min內(nei)，在(zai)450nm波長處(chu)測(ce)定各(ge)孔(kong)的(de)OD值。

實(shi)驗結果計(ji)算

以所測(ce)標(biao)準品(pin)的OD值為橫坐標(biao)，標(biao)準品(pin)的濃度值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐標(biao)紙上或用(yong)相(xiang)關軟(ruan)件(jian)繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線(xian)，並得(de)到(dao)直線(xian)回歸方程，將樣(yang)品(pin)的OD值代(dai)入(ru)方程，計(ji)算出(chu)樣(yang)品(pin)的濃度。

試(shi)劑(ji)盒性能(neng)

1.  檢測(ce)範圍：31.25 pg/ml – 1000 pg/ml。

2.  靈(ling)敏(min)度：檢測(ce)濃度小於(yu)1.0 pg/ml。

3.  特(te)異性(xing)：不(bu)與(yu)其(qi)它(ta)可溶性結構類似(si)物交叉(cha)反(fan)應(ying)。

4.  重復(fu)性：板(ban)內(nei)變(bian)異(yi)系(xi)數小於(yu)10% ，板(ban)間變異(yi)系(xi)數小於(yu)15% 。