小(xiao)鼠丙(bing)二(er)醛（MDA）定(ding)量(liang)檢測試劑盒(he)（ELISA）能(neng)測多少(shao)樣本？

小(xiao)鼠(shu)丙(bing)二(er)醛（MDA）定(ding)量(liang)檢測試劑盒(he)（ELISA）能(neng)測多少(shao)樣本？

上(shang)海(hai)仁捷(jie)生(sheng)物ELISA試劑盒(he)能(neng)測89個樣本

定(ding)量(liang)檢測血(xue)清(qing)、血漿、細胞培養(yang)上清(qing)液中(zhong)小鼠(shu)丙(bing)二(er)醛（MDA）的濃度(du)。

實(shi)驗(yan)原理(li)

本試劑盒(he)采(cai)用競(jing)爭(zheng)法(fa)酶聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附(fu)試驗(yan)（ELISA）。在預(yu)包(bao)被(bei)抗小鼠(shu)丙二(er)醛（MDA）抗體（固(gu)相抗體）的(de)微孔酶標板中，加入小鼠丙(bing)二(er)醛（MDA）校(xiao)準品(pin)和待(dai)測(ce)樣本，再(zai)加入HRP標記(ji)的(de)小鼠丙二(er)醛（MDA）抗原（酶標抗原），經(jing)過(guo)溫育與充(chong)分洗滌(di)，去除(chu)未結(jie)合(he)的組分，在(zai)微孔板固(gu)相表面形成(cheng)固(gu)相抗體-酶標抗原的(de)免疫(yi)復(fu)合(he)物。加底物A和B，底(di)物在(zai)HRP催化(hua)下，產生藍色(se)產(chan)物，在(zai)終止(zhi)液(ye)（2M 硫酸(suan)）作用下，最終轉化(hua)為黃(huang)色(se)，在(zai)酶標儀450nm波長(chang)上測(ce)定吸(xi)光度(du)（OD值），吸(xi)光度(du)（OD值）與待(dai)測樣品(pin)中(zhong)小(xiao)鼠(shu)丙(bing)二(er)醛（MDA）的(de)濃(nong)度(du)負(fu)相關。擬合(he)校(xiao)準品(pin)曲線(xian)，可(ke)以計(ji)算出(chu)樣本中(zhong)小鼠(shu)丙(bing)二(er)醛（MDA）的(de)濃(nong)度(du)。

試劑盒(he)限(xian)制(zhi)性

1、 僅供(gong)科研(yan)使(shi)用，不得用於(yu)臨(lin)床診斷。

2、 在試劑盒(he)標示(shi)的(de)有效期內(nei)使(shi)用，過(guo)期(qi)產品(pin)不得使用。

3、 跟(gen)其(qi)他廠(chang)家的試劑盒(he)或(huo)者(zhe)組分不能(neng)混用。

4、 使用試劑盒(he)配(pei)套(tao)的(de)樣品(pin)稀(xi)釋液。

5、 如果樣本值高(gao)於(yu)最(zui)高(gao)標準品(pin)濃(nong)度(du)值，請將樣本適(shi)當稀(xi)釋後，再(zai)重新測(ce)定。

6、 待測(ce)樣本中(zhong)存在(zai)的(de)人(ren)抗鼠等(deng)異嗜抗體會(hui)幹擾檢測結(jie)果，檢測前(qian)，請排出該因(yin)素(su)。

7、 通過(guo)其(qi)他方(fang)法(fa)得到的檢測結(jie)果，與本(ben)試劑盒(he)測(ce)定結果不具(ju)有直接(jie)的(de)可比性。

技(ji)術提(ti)示(shi)

1、 混合(he)蛋(dan)白(bai)溶(rong)液(ye)時(shi)，避免起泡(pao)。

2、 加校(xiao)準品(pin)與(yu)樣本時(shi)，每個校(xiao)準品(pin)濃(nong)度(du)和樣本都(dou)要(yao)更(geng)換移(yi)液槍(qiang)頭(tou)，公共(gong)組分應(ying)該懸臂加樣，避免交(jiao)叉汙染。

3、 合(he)適的溫育時(shi)間，和充(chong)分的(de)洗滌(di)步驟，是(shi)保(bao)證(zheng)實(shi)驗(yan)結果準確性(xing)的(de)必(bi)要條(tiao)件。

4、 使(shi)用自(zi)動(dong)洗板機時(shi)，加入壹個30秒(miao)浸(jin)泡(pao)的步驟，可(ke)以提(ti)高(gao)檢測精度(du)。

5、 底物溶(rong)液(ye)為(wei)無色(se)液(ye)體，保(bao)存(cun)過(guo)程中(zhong)變(bian)為藍色(se)，代(dai)表(biao)底物溶(rong)液(ye)已(yi)經(jing)失(shi)效，不得使用。

6、 終止(zhi)液(ye)加樣順序(xu)與(yu)底物溶(rong)液(ye)加樣順序(xu)壹致(zhi)，加入終止(zhi)液(ye)後，藍(lan)色(se)底(di)物產(chan)物，會(hui)瞬(shun)間(jian)變(bian)為黃(huang)色(se)。

7、 實(shi)驗(yan)中，用剩(sheng)的(de)板條，應(ying)立即(ji)放回自(zi)封(feng)袋(dai)中，密(mi)封(feng)（低(di)溫幹燥）保(bao)存(cun)。

8、 所有液體(ti)組分，使用前(qian)充(chong)分搖(yao)勻(yun)，嚴(yan)格按(an)照(zhao)說明(ming)書標明的時(shi)間、加樣量(liang)及(ji)加樣順序(xu)進(jin)行(xing)溫育操(cao)作。

試劑盒(he)組分與保(bao)存(cun)

未開封(feng)的(de)試劑盒(he)保(bao)存(cun)在(zai)2-8度(du)，不得使用過(guo)期(qi)試劑盒(he)。

標準品(pin)濃(nong)度(du)依(yi)次(ci)為：24、12、6、3、1.5、0 nmol/mL.

其(qi)他用品(pin)

1、 酶標儀（450nm）

2、 精密(mi)移(yi)液器及(ji)壹次性(xing)吸(xi)頭

3、 蒸(zheng)餾水

4、 洗瓶或者(zhe)自(zi)動(dong)洗板機

5、 37℃水(shui)浴鍋或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)

6、 500ml量(liang)筒(tong)

生物安(an)全(quan)

1、 檢測必(bi)須符(fu)合(he)實(shi)驗(yan)室(shi)管(guan)理(li)規範的規定，嚴(yan)格防(fang)止交(jiao)叉汙染，所(suo)有樣品(pin)、洗棄(qi)液和各(ge)種(zhong)廢(fei)棄物都(dou)應(ying)按(an)照(zhao)傳染(ran)物進(jin)行(xing)處(chu)置(zhi)。

2、 試劑盒(he)的(de)液(ye)體(ti)組分中，含有proclin-300防(fang)腐(fu)劑(ji)，可能(neng)引起皮(pi)膚過(guo)敏(min)反(fan)應(ying)，避免吸(xi)入煙霧與皮(pi)膚接(jie)觸(chu)。

3、 底(di)物液(ye)對(dui)皮(pi)膚、眼睛(jing)和上(shang)呼(hu)吸(xi)道有刺激(ji)作用，避免吸(xi)入煙霧。

4、 戴上(shang)防(fang)護手套(tao)，實(shi)驗(yan)完成(cheng)後洗手。

樣品(pin)的(de)采(cai)集和儲(chu)存(cun)

以下只(zhi)是(shi)列出(chu)樣品(pin)采(cai)集和保(bao)存(cun)的(de)壹般指南(nan)。所有樣本采(cai)集保(bao)存(cun)過(guo)程中(zhong)，不得使用疊(die)氮鈉做為防(fang)腐(fu)劑(ji)。

1、 細胞培養(yang)上清(qing)：4000rpm條件下離心20min，去除(chu)細胞顆粒和聚(ju)合(he)物，上(shang)清(qing)液保(bao)存(cun)在- 20℃以下，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)。

2、 血(xue)清(qing)：使用不含熱(re)原(yuan)和內(nei)毒(du)素(su)的試管，操(cao)作過(guo)程(cheng)中(zhong)避免任何(he)細(xi)胞刺激(ji)，4000rpm條(tiao)件下離心20min，小心(xin)地分(fen)離(li)出血(xue)清(qing)，保(bao)存(cun)在-20℃以下，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)。

3、 血(xue)漿：肝(gan)素(su)，EDTA，或檸檬酸(suan)鈉作為抗凝劑(ji)。在4000rpm條件下，離(li)心(xin)20分鐘取上(shang)清(qing)，血漿保(bao)存(cun)在-20℃以下，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)。

樣本收(shou)集後，無法(fa)壹次檢測完(wan)畢(bi)，請按(an)壹次用量(liang)分裝(zhuang)凍(dong)存(cun)，避免反復(fu)凍(dong)融(rong)，使(shi)用時(shi)在室(shi)溫下解凍(dong)，確保(bao)樣品(pin)均(jun)勻(yun)充(chong)分解凍(dong)。

4、 組織勻(yun)漿：用預(yu)冷(leng)的(de)PBS (0.01 M,pH=7.4)沖(chong)洗組織，去除(chu)殘留(liu)血(xue)液(ye)，稱重後將(jiang)組織剪(jian)碎。將(jiang)剪(jian)碎的(de)組織與對應(ying)體積(ji)的(de)PBS(壹般按(an)1: 9的(de)重量(liang)體積(ji)比(bi)，比如(ru)1g的組織樣品(pin)對(dui)應(ying)9 mL的PBS，具體體積(ji)可(ke)根(gen)據(ju)實(shi)驗(yan)需要(yao)適當(dang)調(tiao)整，並(bing)做(zuo)好記(ji)錄(lu)。推薦在(zai)PBS中(zhong)加入蛋(dan)白(bai)酶抑制(zhi)劑)加入玻璃(li)勻(yun)漿器中(zhong)，在(zai)冰上(shang)充(chong)分研(yan)磨(mo)。為(wei)了進(jin)壹步裂(lie)解組織細胞，可以(yi)對勻(yun)漿液進(jin)行(xing)超(chao)聲破碎或(huo)反復(fu)凍(dong)融(rong)。最(zui)後將(jiang)勻(yun)漿液5000×g離(li)心(xin) 5-10分(fen)鐘，取上(shang)清(qing)檢測。

5、 細(xi)胞提(ti)取(qu)液：貼壁(bi)細(xi)胞用冷(leng)的(de)PBS輕(qing)輕(qing)清(qing)洗，然(ran)後用胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶消化(hua)，1000×g離心5分(fen)鐘後收(shou)集細胞；懸浮(fu)細 胞可直接(jie)離(li)心收(shou)集。收(shou)集的細(xi)胞用冷(leng)的(de)PBS洗滌(di)3次。每 1×106 個細(xi)胞中加入150-200μLPBS重懸並(bing)通(tong)過反(fan)復凍(dong)融(rong)使(shi)細胞破碎(若(ruo)含量(liang)很低(di)可(ke)減(jian)少PBS的體(ti)積(ji))。將(jiang)提(ti)取(qu)液於(yu)1500×g離(li)心(xin)10分(fen)鐘，取上(shang)清(qing)檢測。  

6、 其(qi)他生(sheng)物體(ti)液(ye)：1000×g 離(li)心(xin)20分鐘，除(chu)去雜(za)質(zhi)及(ji)細(xi)胞碎片。取上(shang)清(qing)檢測。

試劑準備

1、 使(shi)用前(qian)，所(suo)有的組分都(dou)要(yao)至少復(fu)溫60min，確保(bao)充(chong)分復(fu)溫到室(shi)溫。

2、 濃縮(suo)洗滌(di)液：從冰箱(xiang)取出的(de)濃縮(suo)洗滌(di)液，會(hui)有結晶(jing)產生(sheng)，這屬於(yu)正(zheng)常(chang)現(xian)象(xiang)，水(shui)浴加熱(re)使(shi)結(jie)晶(jing)溶(rong)解。濃縮(suo)洗滌(di)液與(yu)蒸(zheng)餾水，按(an)1:20稀釋，即(ji)1份的(de)濃縮(suo)洗滌(di)液，添(tian)加19份的(de)蒸(zheng)餾水。

3、 底(di)物：底物液(ye)A和B，在(zai)使(shi)用前(qian)，按(an)1:1體(ti)積(ji)充(chong)分混合(he)，混(hun)合(he)後15分鐘內使(shi)用。

操(cao)作程(cheng)序(xu)

所(suo)有試劑和組分都(dou)先(xian)恢(hui)復(fu)到(dao)室(shi)溫，標準品(pin)、質(zhi)控(kong)品(pin)和樣品(pin)，建(jian)議做復孔。

1、 按(an)前面(mian)說(shuo)明(ming)書描述的方(fang)法(fa)，配制(zhi)好試劑盒(he)各(ge)種(zhong)組分的工(gong)作(zuo)液。

2、 從鋁(lv)箔(bo)袋(dai)中取(qu)出(chu)所(suo)需(xu)板條，剩余的板條用自(zi)封(feng)袋(dai)密(mi)封(feng)放回冰(bing)箱(xiang)。

設(she)置(zhi)標準品(pin)孔、空白(bai)孔和樣本孔，標準品(pin)孔各(ge)加不同(tong)濃(nong)度(du)的(de)標準品(pin)50μL，空(kong)白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。

3、除(chu)空白(bai)孔外，標準品(pin)孔和樣本孔，加入辣根(gen)過(guo)氧化(hua)物酶（HRP）標記(ji)的(de)檢測抗原100μL。

4、 用封(feng)板膜蓋住(zhu)反應(ying)板，37℃水浴鍋或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)溫育60min。

5、 揭(jie)開封(feng)板膜，棄去液體(ti)，吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)幹，每孔加滿洗滌(di)液，靜(jing)置(zhi)20S，甩(shuai)去洗滌(di)液，吸(xi)水紙(zhi)上拍(pai)幹，如此重復5次。若(ruo)使用自(zi)動(dong)洗板機，請按(an)洗板機操(cao)作程(cheng)序(xu)進(jin)行(xing)洗板，添加浸泡(pao)30s的(de)程(cheng)序(xu)，可以提(ti)高(gao)檢測的(de)精度(du)。洗板結束，加底物前(qian)，要(yao)在(zai)幹(gan)凈不掉(diao)屑(xie)的紙上，充(chong)分拍(pai)幹反(fan)應(ying)板。

6、 將底(di)物A和B按(an)1:1體積(ji)充(chong)分混(hun)合(he)，所有孔中加入底物混(hun)合(he)液100μL。用封(feng)板膜蓋住(zhu)反應(ying)板，37℃水浴鍋或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)溫育15min。

7、 所(suo)有孔加入終止(zhi)液(ye)50μL，在酶標儀上讀取(qu)各(ge)孔吸(xi)光度(du)（OD值）。

結果計(ji)算

1、 以標準品(pin)濃(nong)度(du)做(zuo)為(wei)橫(heng)坐標，對應(ying)的吸(xi)光度(du)（OD值）作為(wei)縱坐標，利用計(ji)算機(ji)軟(ruan)件，采(cai)用四(si)參(can)數(shu)Logistic曲線(xian)擬合(he)（4-pl），創建(jian)標準曲線(xian)方(fang)程，通(tong)過樣本的(de)吸(xi)光度(du)（OD值），利用方(fang)程(cheng)計(ji)算樣品(pin)的(de)濃(nong)度(du)值。

2、 如(ru)果樣品(pin)被(bei)稀(xi)釋，通過(guo)上述(shu)方(fang)法(fa)測的濃(nong)度(du)值，要乘(cheng)以稀(xi)釋倍(bei)數(shu)，才(cai)是(shi)樣品(pin)的(de)最(zui)終濃(nong)度(du)。

試劑盒(he)性(xing)能指標

1、物理(li)性(xing)能(neng)

試劑盒(he)的(de)各(ge)液體(ti)組分應(ying)澄(cheng)清(qing)透(tou)明、無沈澱或者(zhe)絮(xu)狀物。微孔板鋁(lv)箔(bo)袋(dai)應(ying)真空包(bao)裝(zhuang)，無破損漏(lou)氣。

2、劑量(liang)反應(ying)曲線(xian)線(xian)性

校(xiao)準品(pin)劑(ji)量(liang)反應(ying)曲線(xian)相關系數(shu)r值，大於(yu)等(deng)於(yu)0.9900。

3、精密(mi)度(du)

批(pi)內精密(mi)度(du)：三組已知(zhi)的(de)高(gao)、中、低(di)濃度(du)樣品(pin)，進(jin)行(xing)二(er)十次(ci)在同(tong)壹個板塊內精度(du)評(ping)估。批內變(bian)異系(xi)數(shu)CV%小(xiao)於(yu)10%。

批(pi)間(jian)精密(mi)度(du)：三組已知(zhi)的(de)高(gao)、中、低(di)濃度(du)樣品(pin)，進(jin)行(xing)二(er)十次(ci)在不同(tong)板塊內精度(du)評(ping)估。批間變(bian)異系(xi)數(shu)CV%小(xiao)於(yu)15%。

4、靈敏度(du)

檢出劑(ji)量(liang)小於(yu)0.1 nmol/mL。

5、回收(shou)率(lv)

三組已知(zhi)的(de)高(gao)、中、低(di)濃度(du)樣品(pin)，進(jin)行(xing)五次(ci)在同(tong)壹個板塊內回收(shou)率(lv)評估，回收(shou)率(lv)在(zai)85%-115%之(zhi)間(jian)。

6、特(te)異性(xing)

本試劑盒(he)識(shi)別(bie)天(tian)然(ran)和重組小鼠(shu)丙(bing)二(er)醛（MDA），與結構類似物無交(jiao)叉。

7、穩(wen)定性

2℃-8℃保(bao)存(cun)，有效期6個(ge)月(yue)。

8、 檢測範圍

0.75 nmol/mL - 24 nmol/mL