Human p-TAU-217 ELISA試(shi)劑盒操作(zuo)原(yuan)理(li)是什麽(me)呢？

Human p-TAU-217 ELISA試劑盒操作(zuo)原(yuan)理(li)是什麽(me)呢？

實驗原(yuan)理(li)

試(shi)劑盒采用雙抗體壹步(bu)夾心(xin)法(fa)酶聯(lian)免(mian)疫吸附(fu)試(shi)驗（ELISA）。往(wang)預(yu)先(xian)包(bao)被(bei)人磷酸化(hua)Tau-217蛋白(bai)（p-TAU-217）捕獲(huo)抗體的(de)包被微(wei)孔中，依(yi)次加入標本、標(biao)準品、HRP標(biao)記(ji)的(de)檢測抗體，經(jing)過溫育並洗(xi)滌。用底(di)物(wu)TMB顯(xian)色，TMB在(zai)過氧化(hua)物(wu)酶的(de)催(cui)化(hua)下轉化(hua)成藍(lan)色，並在(zai)酸的(de)作用下轉化(hua)成最(zui)終(zhong)的(de)黃色。顏(yan)色的(de)深(shen)淺和樣品中的(de)人磷酸(suan)化(hua)Tau-217蛋白(bai)（p-TAU-217）呈正(zheng)相關(guan)。用酶標(biao)儀(yi)在(zai)450nm 波長(chang)下測(ce)定(ding)吸光度（OD 值），計算(suan)樣(yang)品(pin)濃(nong)度(du)。

樣(yang)本(ben)處(chu)理(li)及(ji)要(yao)求

1.  血(xue)清(qing)：將(jiang)收(shou)集於(yu)血(xue)清(qing)分離(li)管(guan)的(de)全血(xue)標(biao)本(ben)在(zai)室溫放置(zhi)2小(xiao)時(shi)或(huo)4℃過夜，然(ran)後(hou)1000×g離(li)心(xin)20 分鐘，取(qu)上(shang)清即可，或(huo)將上(shang)清置(zhi)於-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避(bi)免反(fan)復凍融。
2.  血(xue)漿(jiang)：用EDTA或肝(gan)素作(zuo)為(wei)抗凝劑采集標(biao)本，並將(jiang)標本(ben)在(zai)采集後(hou)的(de)30分鐘內於(yu)2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分鐘，取(qu)上(shang)清即可檢(jian)測，或(huo)將上(shang)清置(zhi)於-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避(bi)免反(fan)復凍融。
3.  組(zu)織(zhi)勻漿(jiang)：用預(yu)冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去(qu)除(chu)殘留血(xue)液(ye)（勻漿(jiang)中裂(lie)解的(de)紅(hong)細(xi)胞會影響(xiang)測(ce)量(liang)結(jie)果），稱(cheng)重後(hou)將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎。將(jiang)剪(jian)碎的(de)組(zu)織(zhi)與(yu)對應(ying)體積的(de)PBS（壹般(ban)按1:9的(de)重量(liang)體積比，比如1g的(de)組(zu)織(zhi)樣品對應(ying)9mL的(de)PBS，具(ju)體體積可根(gen)據實驗需要(yao)適當(dang)調(tiao)整(zheng)，並做(zuo)好(hao)記(ji)錄。推(tui)薦(jian)在(zai)PBS中加入蛋白酶抑制(zhi)劑）加入玻璃(li)勻漿(jiang)器(qi)中，於(yu)冰(bing)上(shang)充分研磨(mo)。為(wei)了進(jin)壹步(bu)裂解組(zu)織(zhi)細(xi)胞，可以(yi)對勻漿(jiang)液(ye)進(jin)行(xing)超(chao)聲(sheng)破(po)碎(sui)，或反(fan)復凍融。最後(hou)將(jiang)勻漿(jiang)液(ye)於(yu)5000×g離(li)心(xin)5~10分鐘，取(qu)上(shang)清檢(jian)測。

4.  細(xi)胞培養(yang)物(wu)上(shang)清或(huo)其它生(sheng)物(wu)標(biao)本(ben)：請1000×g離(li)心(xin)20分鐘，取(qu)上(shang)清即可檢(jian)測，或(huo)將上(shang)清置(zhi)於-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避(bi)免反(fan)復凍融。

註：標(biao)本溶(rong)血(xue)會(hui)影(ying)響(xiang)最後(hou)檢(jian)測結(jie)果，因(yin)此溶(rong)血(xue)標(biao)本(ben)不(bu)宜(yi)進(jin)行(xing)此(ci)項(xiang)檢測(ce)。

需要而未提(ti)供(gong)的(de)試劑和器材

1. 酶標(biao)儀(yi)（450nm）

2. 高(gao)精(jing)度(du)加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或(huo)去(qu)離(li)子水(shui)

試(shi)劑盒組(zu)成

備(bei)註(zhu)：

1.  標(biao)準品濃(nong)度(du)依(yi)次為(wei)：1400、700、350、175、87.5、43.75 pg/mL

2.  經(jing)過大量(liang)正(zheng)常標本檢(jian)驗，標本(ben)的(de)正(zheng)常濃(nong)度(du)值(zhi)均(jun)在(zai)試劑盒提(ti)供(gong)的(de)檢測範(fan)圍內，實驗過程中直(zhi)接取50μL樣(yang)本(ben)上(shang)樣即可。當(dang)有部(bu)分樣本(ben)值超(chao)過最大標(biao)準品濃(nong)度(du)時(shi)，可用樣本(ben)稀(xi)釋(shi)液(ye)將(jiang)標本進(jin)行(xing)適當(dang)稀(xi)釋(shi)後(hou)再進行(xing)實驗。

註意(yi)事(shi)項(xiang)

1. 嚴格(ge)按照規(gui)定(ding)的(de)時(shi)間(jian)和溫度進(jin)行(xing)溫育以(yi)保(bao)證(zheng)準確結(jie)果。所(suo)有試(shi)劑都(dou)必須在(zai)使(shi)用前達(da)到(dao)室溫20-25℃。使(shi)用後(hou)立(li)即冷(leng)藏保存(cun)試(shi)劑。

2. 洗(xi)板不(bu)正(zheng)確可以(yi)導致(zhi)不(bu)準確的(de)結(jie)果。在(zai)加入底(di)物(wu)前(qian)確(que)保盡量(liang)吸幹(gan)孔內液(ye)體。溫育過程中不(bu)要讓(rang)微(wei)孔幹(gan)燥(zao)掉。

3. 消除(chu)板底(di)殘留的(de)液(ye)體和手(shou)指印，否(fou)則影(ying)響OD值(zhi)。

4. 底(di)物(wu)顯(xian)色液(ye)應(ying)呈無(wu)色或(huo)很(hen)淺的(de)顏色，已(yi)經(jing)變藍(lan)的(de)底(di)物(wu)液(ye)不(bu)能(neng)使(shi)用。

5. 避(bi)免試(shi)劑和標本的(de)交(jiao)叉(cha)汙染以免(mian)造(zao)成(cheng)錯(cuo)誤結(jie)果。

6. 在(zai)儲(chu)存(cun)和溫育時(shi)避(bi)免強(qiang)光直接照射(she)。

7. 平(ping)衡(heng)至室溫後(hou)再打開(kai)密封袋(dai)以(yi)防(fang)水(shui)滴(di)凝聚(ju)在(zai)冷板條(tiao)上(shang)。

8. 任何(he)反(fan)應(ying)試劑不(bu)能(neng)接(jie)觸漂(piao)白(bai)溶(rong)劑或(huo)漂(piao)白(bai)溶(rong)劑所(suo)散(san)發的(de)強(qiang)烈(lie)氣(qi)體。任何(he)漂(piao)白(bai)成(cheng)分都(dou)會破(po)壞(huai)試劑盒中反(fan)應(ying)試劑的(de)生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)。

9. 不能(neng)使(shi)用過期(qi)產(chan)品。

10. 如果可能(neng)傳播疾(ji)病(bing)，所(suo)有的(de)樣品都(dou)應(ying)管(guan)理(li)好(hao)，按照規(gui)定(ding)的(de)程序(xu)處理(li)樣(yang)品(pin)和檢測裝置(zhi)。

試(shi)劑準備

試(shi)劑盒從冷(leng)藏環(huan)境(jing)中取(qu)出應(ying)在(zai)室溫平(ping)衡(heng)後(hou)方(fang)可使(shi)用。

20×洗滌(di)緩(huan)沖液(ye)的(de)稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份20×洗(xi)滌緩沖(chong)液(ye)加19份蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)

1.  從室溫平(ping)衡(heng)20min後(hou)的(de)鋁箔袋(dai)中取(qu)出所(suo)需(xu)板條(tiao)，剩余(yu)板條(tiao)用自封袋(dai)密封放回(hui)4℃。

2.  設(she)置(zhi)標(biao)準品孔和樣本孔，標(biao)準品孔各(ge)加不同濃(nong)度(du)的(de)標準品50μL；

3.  樣(yang)本(ben)孔中加入待測樣本50μL；空(kong)白(bai)孔不(bu)加。

4.  除(chu)空(kong)白(bai)孔外(wai)，標準品孔和樣本孔中每(mei)孔加入辣根(gen)過氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標(biao)記(ji)的(de)檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(ying)孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋(guo)或(huo)恒溫箱溫育60min。

5.  棄(qi)去(qu)液(ye)體，吸水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹(gan)，每(mei)孔加滿(man)洗(xi)滌液(ye)（350μL），靜置(zhi)1min，甩去(qu)洗(xi)滌液(ye)，吸水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹(gan)，如此重復洗板5次（也(ye)可用洗板機(ji)洗板）。

6.  每(mei)孔加入底(di)物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避(bi)光孵(fu)育15min。

7.  每(mei)孔加入終(zhong)止液(ye)50μL，15min內，在(zai)450nm波長(chang)處測(ce)定(ding)各(ge)孔的(de)OD值。

實驗結(jie)果計(ji)算

以所(suo)測標準品的(de)OD值為(wei)橫(heng)坐(zuo)標，標(biao)準品的(de)濃(nong)度(du)值(zhi)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標，在(zai)坐(zuo)標紙(zhi)上(shang)或用相關(guan)軟件(jian)繪制(zhi)標(biao)準曲(qu)線，並得(de)到直(zhi)線回(hui)歸(gui)方(fang)程，將(jiang)樣品(pin)的(de)OD值代入(ru)方(fang)程，計(ji)算出樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。

試(shi)劑盒性(xing)能(neng)

1.  檢(jian)測範(fan)圍：43.75 pg/mL – 1400 pg/mL。

2.  靈敏度：檢(jian)測濃(nong)度(du)小(xiao)於1.0 pg/mL。

3.  特(te)異(yi)性(xing)：不與(yu)其它可溶(rong)性(xing)結(jie)構類(lei)似物(wu)交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)。

4.  重復性(xing)：板內變異(yi)系(xi)數(shu)小(xiao)於10% ，板間(jian)變異(yi)系(xi)數(shu)小(xiao)於15% 。