人(ren)半乳糖(tang)凝集素(su)9(Gal-9)ELISA試劑(ji)盒原理(li)

本(ben)試劑(ji)盒用於(yu)體(ti)外定量(liang)檢(jian)測血清、血漿、組(zu)織勻漿及(ji)相(xiang)關液(ye)體(ti)樣(yang)本(ben)中人半乳糖(tang)凝集素(su)9(Gal-9)的含(han)量。

 人半乳糖(tang)凝集素(su)9(Gal-9)ELISA試劑(ji)盒原理(li)

實(shi)驗原理(li)：

試劑(ji)盒采(cai)用(yong)雙(shuang)抗體(ti)壹步(bu)夾(jia)心(xin)法(fa)酶聯(lian)免疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗（ELISA）。往預(yu)先包(bao)被人(ren)半乳糖(tang)凝集素(su)9(Gal-9)捕(bu)獲抗體的包(bao)被微孔中，依次(ci)加(jia)入(ru)標(biao)本(ben)、標準(zhun)品、HRP標(biao)記(ji)的檢(jian)測抗體(ti)，經(jing)過溫(wen)育並(bing)*洗(xi)滌(di)。用底物(wu)TMB顯色，TMB在過氧(yang)化(hua)物(wu)酶的催(cui)化下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)藍(lan)色，並在酸的(de)作(zuo)用下轉(zhuan)化成(cheng)最(zui)終(zhong)的(de)黃色。顏(yan)色的深(shen)淺和(he)樣(yang)品中的人(ren)半乳糖(tang)凝集素(su)9(Gal-9)呈(cheng)正(zheng)相(xiang)關。用(yong)酶標儀(yi)在450nm 波(bo)長(chang)下測定吸(xi)光(guang)度(du)（OD 值），計(ji)算樣(yang)品濃度(du)。

樣本(ben)處理(li)及(ji)要求(qiu)：

1.  血清：將(jiang)收(shou)集於(yu)血清分(fen)離(li)管的(de)全血標本(ben)在室溫(wen)放(fang)置(zhi)2小(xiao)時或4℃過夜，然後1000×g離心(xin)20 分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)即(ji)可(ke)，或將上(shang)清(qing)置(zhi)於-20℃或-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。

2.  血漿：用(yong)EDTA或肝素(su)作為抗(kang)凝劑(ji)采(cai)集標(biao)本(ben)，並將(jiang)標本(ben)在采(cai)集後的30分鐘(zhong)內於2-8℃ 1000×g離心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)即(ji)可(ke)檢(jian)測，或將上(shang)清(qing)置(zhi)於-20℃或-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。

3.  組(zu)織勻漿：用(yong)預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗(xi)組(zu)織，去除殘留血液（勻漿中裂解(jie)的(de)紅細胞(bao)會影響測量結(jie)果(guo)），稱(cheng)重(zhong)後將組(zu)織剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)組(zu)織與對應體積的PBS（壹般按(an)1:9的重(zhong)量(liang)體(ti)積比(bi)，比(bi)如1g的組(zu)織樣(yang)品對應9mL的PBS，具體(ti)體積可根據實(shi)驗需(xu)要適當(dang)調整(zheng)，並做好記(ji)錄。推薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋白(bai)酶抑制(zhi)劑(ji)）加(jia)入(ru)玻(bo)璃勻漿器中，於冰(bing)上(shang)充分研磨(mo)。為了(le)進壹步(bu)裂(lie)解組(zu)織細(xi)胞(bao)，可以對勻漿液(ye)進行超(chao)聲(sheng)破(po)碎(sui)，或反(fan)復凍融。最(zui)後將勻漿液(ye)於(yu)5000×g離心(xin)5~10分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)檢(jian)測。

4.  細胞(bao)培(pei)養物(wu)上(shang)清(qing)或其它生物(wu)標(biao)本(ben)：請(qing)1000×g離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)，取(qu)上(shang)清(qing)即(ji)可(ke)檢(jian)測，或將上(shang)清(qing)置(zhi)於-20℃或-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。

註(zhu)：標本(ben)溶(rong)血會影響最(zui)後檢(jian)測結果(guo)，因(yin)此溶(rong)血標本(ben)不宜進行此項檢(jian)測。

需(xu)要而(er)未提供(gong)的(de)試劑(ji)和(he)器材：

1. 酶標儀(yi)（450nm）

2. 高(gao)精(jing)度(du)加(jia)樣(yang)器及(ji)槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱(xiang)

4. 蒸(zheng)餾(liu)水或去離子水

試劑(ji)盒組(zu)成(cheng)：

備註(zhu)：

1.  標準(zhun)品濃度(du)依次(ci)為：100、50、25、12.5、6.25、3.125 pg/mL

2.  經(jing)過大(da)量正(zheng)常標本(ben)檢(jian)驗，標本(ben)的正(zheng)常濃度(du)值均在試劑(ji)盒提供(gong)的(de)檢(jian)測範圍(wei)內，實(shi)驗過程(cheng)中直接取(qu)50μL樣本(ben)上(shang)樣(yang)即(ji)可(ke)。當有部(bu)分(fen)樣(yang)本(ben)值超(chao)過最(zui)大(da)標準(zhun)品濃度(du)時，可用(yong)樣(yang)本(ben)稀(xi)釋液將(jiang)標(biao)本(ben)進行適當(dang)稀(xi)釋後再進行實(shi)驗。

註(zhu)意事(shi)項：

1. 嚴(yan)格(ge)按照規定的(de)時間(jian)和(he)溫(wen)度(du)進行溫(wen)育以(yi)保證準(zhun)確結(jie)果(guo)。所(suo)有試劑(ji)都必須(xu)在使(shi)用前達(da)到(dao)室(shi)溫(wen)20-25℃。使(shi)用後立(li)即冷藏保存試劑(ji)。

2. 洗(xi)板(ban)不正(zheng)確(que)可以(yi)導致(zhi)不準(zhun)確的(de)結(jie)果(guo)。在加(jia)入(ru)底物(wu)前(qian)確(que)保盡量(liang)吸(xi)幹孔內液體。溫(wen)育(yu)過(guo)程中不要(yao)讓(rang)微孔幹燥(zao)掉(diao)。

3. 消(xiao)除板底殘留的(de)液體(ti)和(he)手(shou)指印(yin)，否(fou)則影響OD值。

4. 底物(wu)顯色液應呈(cheng)無色或很淺的顏(yan)色，已(yi)經(jing)變藍(lan)的(de)底物(wu)液(ye)不能(neng)使(shi)用。

5. 避免(mian)試劑(ji)和(he)標(biao)本(ben)的交叉汙染以免(mian)造(zao)成(cheng)錯(cuo)誤(wu)結(jie)果(guo)。

6. 在儲存(cun)和(he)溫(wen)育(yu)時避免(mian)強光(guang)直(zhi)接照射(she)。

7. 平衡(heng)至室溫後再打開密(mi)封袋以防水(shui)滴(di)凝聚(ju)在冷板條上(shang)。

8. 任何(he)反(fan)應試劑(ji)不能(neng)接觸漂(piao)白溶(rong)劑(ji)或漂(piao)白溶(rong)劑(ji)所散發的(de)強烈氣(qi)體。任何(he)漂(piao)白成(cheng)分(fen)都會破(po)壞試劑(ji)盒中反(fan)應試劑(ji)的生物(wu)活(huo)性(xing)。

9. 不能(neng)使(shi)用過期(qi)產(chan)品。

10. 如果可能(neng)傳播(bo)疾(ji)病，所(suo)有的(de)樣品都應管理(li)好，按(an)照規定的(de)程(cheng)序處(chu)理(li)樣(yang)品和(he)檢(jian)測裝置(zhi)。

試劑(ji)準(zhun)備：

試劑(ji)盒從(cong)冷藏環境(jing)中取(qu)出應在室溫(wen)平(ping)衡後方(fang)可(ke)使(shi)用。

20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾(liu)水按(an)1：20稀(xi)釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖(chong)液(ye)加(jia)19份(fen)蒸(zheng)餾(liu)水。

操(cao)作步驟(zhou)：

1.  從(cong)室溫平(ping)衡(heng)20min後的鋁(lv)箔袋(dai)中取(qu)出所(suo)需(xu)板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自封袋(dai)密(mi)封放(fang)回(hui)4℃。

2.  設(she)置(zhi)標準(zhun)品孔和(he)樣(yang)本(ben)孔，標(biao)準(zhun)品孔各(ge)加(jia)不同(tong)濃度(du)的標(biao)準(zhun)品50μL；

3.  樣(yang)本(ben)孔中加(jia)入(ru)待(dai)測樣本(ben)50μL；空白孔不加(jia)。

4.  除(chu)空白孔外(wai)，標(biao)準(zhun)品孔和(he)樣(yang)本(ben)孔中每孔加(jia)入(ru)辣(la)根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標記(ji)的檢(jian)測抗體(ti)100μL，用(yong)封板膜封住反(fan)應孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒溫箱(xiang)溫(wen)育(yu)60min。

5.  棄去液體，吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹，每孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液（350μL），靜(jing)置(zhi)1min，甩去洗(xi)滌(di)液，吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹，如此重(zhong)復洗(xi)板(ban)5次(ci)（也(ye)可(ke)用(yong)洗(xi)板(ban)機洗(xi)板(ban)）。

6.  每孔加(jia)入(ru)底物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避(bi)光(guang)孵(fu)育(yu)15min。

7.  每(mei)孔加(jia)入(ru)終(zhong)止(zhi)液50μL，15min內，在450nm波(bo)長(chang)處測定各(ge)孔的(de)OD值。

實(shi)驗結果(guo)計(ji)算：

以(yi)所測標準(zhun)品的(de)OD值為橫(heng)坐(zuo)標，標(biao)準(zhun)品的(de)濃度(du)值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在坐標(biao)紙(zhi)上(shang)或用相關軟(ruan)件(jian)繪(hui)制(zhi)標準(zhun)曲(qu)線(xian)，並(bing)得(de)到(dao)直(zhi)線(xian)回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)，將樣品的(de)OD值代(dai)入(ru)方(fang)程(cheng)，計(ji)算出(chu)樣品的(de)濃度(du)。

     （此圖僅(jin)供(gong)參(can)考）                                                    

試劑(ji)盒性能(neng)：

1.  檢(jian)測範圍(wei)：3.125 pg/mL – 100 pg/mL。

2.  靈敏度(du)：檢(jian)測濃度(du)小(xiao)於0.1pg/mL。

3.  特異(yi)性：不與其它(ta)可溶(rong)性(xing)結(jie)構(gou)類似(si)物(wu)交叉反(fan)應。

4.  重(zhong)復性：板內變異(yi)系數(shu)小(xiao)於10% ，板間(jian)變異(yi)系數(shu)小(xiao)於15% 。