壹(yi)文看懂(dong)魚ELISA試劑(ji)盒的(de)實(shi)驗條(tiao)件(jian)和要(yao)求

　　魚ELISA試劑(ji)盒的(de)實(shi)驗要(yao)求(qiu)：

　　壹(yi)、做好對照(zhao)

　　正式(shi)試驗時(shi)，應(ying)分(fen)別(bie)以(yi)陽性(xing)對照(zhao)與陰(yin)性(xing)對照(zhao)控制(zhi)試(shi)驗條(tiao)件(jian)，待檢(jian)樣(yang)品應(ying)作(zuo)壹(yi)式(shi)二份，以(yi)保證實(shi)驗結(jie)果(guo)的(de)準(zhun)確性(xing)。有(you)時(shi)本底較高(gao)，說(shuo)明(ming)有(you)非特(te)異(yi)性(xing)反(fan)應(ying)，可(ke)采用羊(yang)血清(qing)、兔(tu)血清(qing)或(huo)BSA等(deng)封閉(bi)。

　　二、實(shi)驗條(tiao)件(jian)的(de)選(xuan)擇

　　在(zai)ELISA中(zhong)，進行各項(xiang)實(shi)驗條(tiao)件(jian)的(de)選(xuan)擇是(shi)很重(zhong)要(yao)的(de)，其(qi)中(zhong)包(bao)括:

　　(1)　固相載(zai)體的(de)選(xuan)擇：許多(duo)物(wu)質(zhi)可(ke)作(zuo)為(wei)固(gu)相載(zai)體，如(ru)聚(ju)氯(lv)乙(yi)烯(xi)、聚(ju)苯乙(yi)烯(xi)、聚(ju)丙(bing)酰胺(an)和纖(xian)維素等(deng)。其形(xing)式(shi)可(ke)以(yi)是凹(ao)孔(kong)平板、試管(guan)、珠(zhu)粒等(deng)。常用的(de)是(shi)40孔聚(ju)苯乙(yi)烯(xi)凹(ao)孔(kong)板。不管何(he)種(zhong)載(zai)體，在(zai)使用(yong)前均(jun)可(ke)進行篩選(xuan)：用等(deng)量抗(kang)原包(bao)被，在(zai)同(tong)壹(yi)實(shi)驗條(tiao)件(jian)下(xia)進行反(fan)應(ying)，觀(guan)察其顯(xian)色反(fan)應(ying)是(shi)否(fou)均(jun)壹(yi)性(xing)，據此判明(ming)其吸(xi)附性(xing)能(neng)是(shi)否良(liang)好。

　　(2) 包(bao)被抗(kang)體(或(huo)抗(kang)原)的(de)選(xuan)擇：將(jiang)抗(kang)體(或(huo)抗(kang)原)吸(xi)附在(zai)固相載(zai)體表(biao)面(mian)時，要(yao)求純(chun)度要(yao)好,吸(xi)附時(shi)壹般要求PH在(zai)9.0～9.6之間。吸(xi)附溫(wen)度，時(shi)間及其(qi)蛋(dan)白(bai)量也有(you)壹(yi)定(ding)影(ying)響,壹(yi)般多采用4℃ 18～24小(xiao)時(shi)。蛋(dan)白(bai)質(zhi)包(bao)被的(de)較(jiao)適濃(nong)度需(xu)進(jin)行滴定(ding)：即(ji)用不同(tong)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃(nong)度(0.1、1.0和10μg/ml等(deng))進行包(bao)被後，在(zai)其它試驗條(tiao)件(jian)相同(tong)時(shi)，觀(guan)察陽性(xing)標(biao)本的(de)OD值(zhi)。選(xuan)擇OD值(zhi)較(jiao)大(da)而(er)蛋白(bai)量較(jiao)少的(de)濃(nong)度。對於多(duo)數蛋白(bai)質(zhi)來(lai)說通(tong)常為1～10μg/ml。

　　(3)　酶(mei)標(biao)記抗(kang)體工(gong)作(zuo)濃(nong)度的(de)選(xuan)擇：首先用直(zhi)接(jie)ELISA法進行初步效(xiao)價(jia)的(de)滴定(ding)(見(jian)酶(mei)標(biao)記抗(kang)體部(bu)份(fen))。然後再(zai)固定(ding)其(qi)它(ta)條(tiao)件(jian)或采取“方(fang)陣(zhen)法”(包(bao)被物(wu)、待(dai)檢(jian)樣(yang)品的(de)參(can)考品及(ji)酶標(biao)記抗(kang)體分(fen)別(bie)為(wei)不(bu)同(tong)的(de)稀(xi)釋度)在(zai)正式(shi)實(shi)驗系統(tong)裏準(zhun)確地滴定(ding)其(qi)工(gong)作(zuo)濃(nong)度。

　　(4)　酶(mei)的(de)底(di)物(wu)及(ji)供氫(qing)體的(de)選(xuan)擇：對供氫(qing)體的(de)選(xuan)擇要(yao)求(qiu)是(shi)價(jia)廉(lian)、安全、有(you)明(ming)顯地(di)顯色反(fan)應(ying)，而(er)本身無色。有(you)些供氫(qing)體(如(ru)OPD等(deng))有(you)潛在(zai)的(de)致(zhi)癌(ai)作(zuo)用(yong)，應(ying)註(zhu)意防護(hu)。有(you)條(tiao)件(jian)者(zhe)應(ying)使用(yong)不致(zhi)癌(ai)、靈(ling)敏(min)度高(gao)的(de)供氫(qing)體，如(ru)TMB和ABTS是(shi)較為(wei)滿意的(de)供氫(qing)體。底(di)物(wu)作(zuo)用(yong)壹(yi)段(duan)時(shi)間後，應(ying)加(jia)入(ru)強酸(suan)或強堿(jian)以(yi)終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)。通(tong)常底物(wu)作(zuo)用(yong)時(shi)間，以(yi)10-30分鐘為宜。底物(wu)使用(yong)液必(bi)須(xu)新(xin)鮮(xian)配制(zhi)，尤(you)其(qi)是(shi)H2O2在(zai)臨(lin)用(yong)前加(jia)入(ru)。

　　進口分(fen)裝(zhuang)：

　　檢(jian)測範圍和靈(ling)敏(min)度不(bu)同(tong)，用(yong)量少時，可(ke)使用(yong)分裝(zhuang)，前(qian)期是(shi)它(ta)的(de)長(chang)久性(xing)不是很好。

　　試劑(ji)盒的(de)標(biao)準曲線(xian)較(jiao)高(gao)點(dian)OD 值均(jun)在(zai)2.0±0.2，零(ling)孔(kong)的(de)OD 值(zhi)都控(kong)制(zhi)在(zai)0.10以(yi)下(xia)。

　　試劑(ji)盒的(de)標(biao)準曲線(xian)相關系數R≥0.98。

　　試劑(ji)盒重復(fu)性(xing)好，板內、板(ban)間變異(yi)系數均(jun)<9 %。

　　試(shi)劑(ji)的(de)組(zu)份都多(duo)給(gei)20%的(de)富(fu)余(yu)量(liang)，確保完成(cheng)48/96孔(kong)的(de)檢(jian)測，避(bi)免分(fen)次檢(jian)測可(ke)能(neng)造(zao)成試(shi)劑(ji)量不足(zu)的(de)情(qing)況。

　　檢(jian)測抗(kang)體及(ji)酶(mei)結合物(wu)的(de)稀(xi)釋度合適(均(jun)為(wei)1:30), 方(fang)便(bian)試(shi)驗操(cao)作(zuo)者(zhe)準確地做稀(xi)釋工(gong)作(zuo)，保(bao)證實(shi)驗結(jie)果(guo)的(de)重(zhong)復(fu)性(xing)。